Control of the HLA antigen processing pathways by the HLA class III-encoded BAT3
Final Report Abstract
Das in der HLA Klasse III Region kodierte BAT3( auch als BAG6 bezeichnet) spielt eine zentrale Rolle bei der Qualitätskontrolle von neu synthetisierten Proteinen in der Zelle. BAG6 verhindert als Chaperon die Aggregation von nicht gefalteten Polypeptiden und führt fehlgefaltete Proteine zur proteosomaler Degradation. Wir haben eine neue Rolle von BAG6 für die Ausbildung des Zytoskeletts und für das Wachstum von Zellen entdeckt. Dabei spielen Varianten von BAG6 eine Rolle, die durch alternatives Splicen der pre-mRNA entstehen. Durch Splicen des Exons 24 wird ein großer Teil der BAG Domäne von BAG6 deletiert. Die BAG Domäne interagiert mit Hitzeschockproteinen und mit einer großen Anzahl anderer Liganden. Durch Inaktivierung des BAG6 Gens mit der CRISPR/Cas9 Methode konnten wir zeigen, dass BAG6 für die Ausbildung der Aktinstruktur und der Verteilung von Mikrotubuli in der Zelle verantwortlich ist. Neben dem Zytoskelett wird auch die Struktur des Endoplasmatischen Retikulums und die Dynamik der Plasmamembran durch die Expression von BAG6 kontrolliert. An der Steuerung der Membrandynamik durch das Aktinskelett sind Adaptoren beteiligt, deren zelluläre Verteilung durch BAG6 Varianten kontrolliert wird. Durch Rekonstitution der BAG6 k.o. Zellen mit BAG Varianten konnten wir zeigen, dass nur die Varianten mit vollständiger BAG Domäne den ursprünglichen Phänotyp wieder herstellten. Außerdem wurde das Migrationsverhalten von Zellen durch Inaktivierung von BAG6 verändert. Das veränderte Zellwachstum zeigte sich dabei durch epitheliale (beim Wildtyp) versus mesenchymale Morphologie beim BAG6 knockout. Dies könnte für Tumorwachstum und Metastasierung von Zellen von Bedeutung sein. Durch Massenspektrometrie haben wir Liganden identifiziert, die jeweils spezifisch an BAG6 Varianten mit vollständiger oder verkürzter BAG Domäne binden. BAG6 Varianten pendeln in der Zelle zwischen Zytoplasma und Zellkern. Dabei finden sich die Varianten mit vollständiger BAG Domäne überwiegend im Zellkern und die Varianten mit BAG Deletion zusätzlich im Zytoplasma. Unmittelbar neben der BAG Domäne findet sich in BAG6 eine Sequenz, die als Kernlokalisierungssignal (NLS) identifiziert wurde. Wir haben festgestellt, dass diese NLS durch die Exon 24 Sequenz verlängert wird. Dies bedeutet, dass beim Splicen von Exon 24 eine Variante entsteht, bei der das Kernlokalisierungssignal beeinträchtigt ist. Dies erklärt, weshalb die Variante mit verkürzter BAG Domäne im Zytoplasma zu finden ist. Durch das Splicen der pre-mRNA wird auf diese Weise die zelluläre Lokalisation von BAG6 gesteuert. Ein weiteres Signal, dass in der Bindungsseite der Ubiquitinligase RNF126 liegt, steuert den Kernexport von BAG6. Das Splicen der pre-mRNA wird durch Splice Faktoren erreicht, die an flankierende Intronsequenzen binden. Im Intron des BAG6 Gens, das zwischen den Exons 24 und 25 liegt befinden sich zwei SNPs (rs743400 und rs750332). Im Bereich dieser SNPs liegt eine Bindestelle für SRSF5. Mit einer Sensorkonstruktion haben wir die Spliceaktivität der möglichen SNP Kombinationen getestet und festgestellt, dass die SNPs das Splicen der Transkripte beeinflussten. Dies deutete darauf hin, dass SRSF5 das Splicen der BAG6 Transkripte kontrolliert. Da die verschiedenen BAG6 Varianten die Zellmorphologie verändern haben, wird durch eine kontrollierte Änderung der Zelldichte das Zellwachstum beeinflusst. Durch Western Blot der Lysate dieser Zellen konnten wir anschließend zeigen, dass SRSF5 mit steigender Zelldichte stark zunimmt. Im Gegensatz dazu nimmt die Menge der BAG6 Variante mit kompletter BAG Domäne in ihrer Intensität ab. Dies bedeutet, durch die Zelldichte wird das Splicen der BAG6 Transkripte kontrolliert. Diese Regulation findet sich nicht in BAG6 k.o. Zellen. Wir fanden einen Rückkopplungsmechanismus von BAG6, der die Expression von SRSF5 und damit das Splicen von BAG6 Transkripten kontrolliert. Das Projekt hat eine unerwartete Wende genommen. Durch die Entdeckung der zentralen Rolle von BAT3/BAG6 beim Zellwachstum und für die Zellmorphologie sind die immunologischen Ziele des Antrags in den Hintergrund getreten. Die erzielten Ergebnisse gehen allerdings in ihrer Bedeutung wesentlich über die ursprünglich formulierten Ziele hinaus. Unsere Ergebnisse haben eine große Bedeutung auch für die Ausprägung des Immunsystems.
Publications
- 2012. A Novel BAT3 Sequence Generated by Alternative RNA Splicing of Exon 11B Displays Cell Type-Specific Expression and Impacts on Subcellular Localization. PLoS ONE 7(4): e35972
Kämper N, Kessler J, Temme S, Wegscheid C, Winkler J, and Koch, N.
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035972) - 2012. Gamma Interferon Regulated Chaperone Governs Human Lymphocyte Antigen Class II Expression. FASEB J. 26: 104-116
Kämper, N., Franken , S., Temme, S., Koch, S., Bieber, T., and Koch, N.
(See online at https://doi.org/10.1096/fj.11-189670) - 2014. A novel family of human lymphocyte antigen class II receptors may have its origin in archaic human species. J. Biol. Chem. 289:639-653
Temme, S., Zacharias, M., Neumann, J., Wohlfromm, S., König, A., Kämper, N., Springer, S., Trowsdale, J., and Koch, N.
(See online at https://doi.org/10.1074/jbc.M113.515767)
