Oxidation of protein-tyrosine phosphatases in oncogenic cell transformation
Final Report Abstract
Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) sind enzymatische Gegenspieler von Protein-Tyrosinkinasen (PTK). Die Aktivität von PTP und wahrscheinlich auch von einigen PTK wird durch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) reguliert. Biochemische Grundlage dafür ist die reversible Oxidation von Cystein-Resten in den betreffenden Enzymen. Bei PTP ist dies vor allem ein Cystein-Rest im aktiven Zentrum, dessen Oxidation zur Hemmung führt. Bei PTK ist die regulatorische Rolle von Cysteinen weniger gut charakterisiert. Die Bedeutung von PTP und die ROS-vermittelte Regulation von PTP und PTK in Tumorerkrankungen sind noch wenig verstandene Mechanismen, die grundsätzliche und potentiell auch translationale Bedeutung haben. In zwei Projektabschnitten haben wir diese Prozesse in Zellen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) untersucht, in denen das Onkoprotein FLT3ITD (Fms-like tyrosine kinase with internal tandem duplications) exprimiert war. Bei FLT3ITD handelt es sich um eine konstitutiv aktive Rezeptor-PTK. Mutationen im FLT3 Gen, die zur Expression dieser mutierten Version führen, sind häufig und bedingen eine schlechte Prognose der Leukämie- Erkrankung. Diese Zellen weisen erhöhte Spiegel an ROS auf, die auf noch unvollständig verstandene Weise zur leukämischen Zelltransformation beitragen. Die fehlerhafte Regulation von PTP und PTK durch ROS könnte eine Rolle dabei spielen. Im ersten Projektabschnitt konnten wir teilweise aufklären, warum ROS in FLT3ITD-positiven Zellen vermehrt gebildet werden: Durch FLT3ITD wird in den Leukämiezellen sehr stark STAT5 aktiviert, das an den Promotor für das Gen der NADPH-Oxidase 4 (NOX4) bindet und die Expression des Gens erhöht. Da NOX4 konstitutiv aktiv ist, hat dies eine erhöhte ROS-Produktion zur Folge. Die Verringerung der NOX4 Spiegel mit genetischen Methoden inhibierte das Vermögen der Zellen in vitro und in Mausmodellen in vivo zu wachsen. Dadurch wurde NOX4 als potentiell interessantes Target identifiziert. NOX4 abhängige ROS Produktion führt zur Inaktivierung von PTP, darunter der Transmembran PTP DEP-1/PTPRJ, worüber sich der promovierende Effekt von NOX4 auf die Zelltransformation teilweise erklärt. Im zweiten Projektabschnitt wurde mit SHP1/PTPN6 eine weitere, in Zellen der FLT3ITD-positiven Leukämie hoch exprimierte PTP, auf ihre Relevanz in den Leukämiezellen untersucht. Überraschenderweise hatte die genetische Herabsetzung der SHP1-Spiegel einen abschwächenden Effekt auf die FLT3ITD-abhängige Zelltransformation in vitro und in vivo. Ein dafür relevanter Signalweg beinhaltet STAT6, ein direktes Substrat von SHP1, und Integrin β3, welches durch aktives STAT6 in der Expression erhöht wird. Reduktion der SHP1 Expression, Hemmung von SHP1 mit einem niedermolekularen Wirkstoff, Überexpression von ITGB3, oder die starke Aktivierung der STAT6-ITGB3-Achse mit IL4 hemmten die FLT3ITD-abhängige Zelltransformation. Auch dieser Signalweg könnte translationale Relevanz haben. Wir untersuchten weiterhin, ob die FLT3ITD-getriebene ROS Produktion auch zu einer Regulation der PTK FLT3ITD selbst führen könnte. Die Daten zeigen, dass FLT3ITD in intakten Zellen offenbar an bestimmten zytoplasmatischen Cystein-Resten oxidiert wird. Cystein-zu-Serin-Mutationen an mehreren Positionen bewirkten starke Phänotypen in der FLT3ITD Signaltransduktion und Zelltransformation, was die regulatorische Potenz von Cystein-Modifikationen in diesem Onkoprotein unterstreicht.
Publications
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