Biosynthese von 2-Alkyl-4-hydroxychinolinen durch Pseudomonas aeruginosa: Charakterisierung der Flavin-Monooxygenasen PqsH and PqsL und akzessorischer Proteine

• Antragstellerin: Professorin Dr. Susanne Fetzner
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 229433240

2-Alkyl-4(1H)-chinolone (AQs) und 2-Alkyl-4-hydroxychinolin-N-oxide (AQNOs) sind von Pseudomonas aeruginosa produzierte Sekundärmetaboliten mit vielfältigen biologischen Aktivitäten, u.a. als antimikrobielle oder auch immunmodulierende Wirkstoffe sowie Signalmoleküle der bakteriellen Kommunikation (quorum sensing). Die Biosynthese von AQs und AQNOs durch P. aeruginosa erfordert die von pqsABCDE, pqsH und pqsL kodierten Proteine, die beteiligten biochemischen Prozesse sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen des vorherigen Vorhabens zu Enzymen der AQ-Biosynthese konnten wir die unerwartete Beteiligung des Proteins PqsE als Thioesterase im Biosyntheseweg nachweisen. Zudem konnten wir das condensing-Enzym PqsBC, das die Synthese von 2-Heptyl-4(1H)-chinolon (HHQ) aus Octanoyl-Coenzym A und 2-Aminobenzoylacetat katalysiert, strukturell und mechanistisch charakterisieren, und seine kompetitive Hemmung durch 2-Aminoacetophenon (ebenfalls ein Produkt des Biosynthesewegs) beschreiben. Ziel des beantragten Vorhabens ist die Charakterisierung der Flavin-Monooxygenasen PqsH und PqsL, die für die Bildung der hauptsächlichen Endprodukte, des Signalmoleküles PQS (Pseudomonas quinolone signal, 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon) und des Atmungsketten-inhibitors HQNO (2-Heptyl-4-hydroxychinolin-N-oxid) essentiell sind. Die HHQ-3-Monooxygenase PqsH ist vermutlich mit der Cytoplasmamembran oder einem Membranprotein assoziiert. Wir werden die subzelluläre Lokalisation von wildtypischem und trunkiertem PqsH-Protein charakterisieren und den Einfluss assoziierter Faktoren auf die Enzymaktivität analysieren. Außerdem soll untersucht werden, ob die Aktivität von PqsH durch Produkte des Biosyntheseweges moduliert wird (ähnlich wie für PqsBC nachgewiesen) und ob HQNO, das ebenfalls von PqsH hydroxyliert wird, ein physiologisch relevanter Vorläufer von PQS ist. Im Rahmen bisheriger Arbeiten konnten wir zeigen, dass die PqsL-Reaktion eine Flavinreduktase-Komponente benötigt, was angesichts der Zugehörigkeit von PqsL zur UbiH Enzymfamilie überraschte. Außerdem scheint die PqsL-Reaktion in unbekannter Weise an die PqsBC-Reaktion gekoppelt zu sein. Das Substrat von PqsL ist nach wie vor unbekannt. Die Charakterisierung der Funktionsweise von PqsL und die Aufklärung der Struktur in Komplex mit (Co-)Substrat (in Kooperation mit Prof. Mattevi, Padua) sollen Einblick in den Mechanismus dieser ungewöhnlichen Monooxygenase geben und die Frage beantworten, wie P. aeruginosa AQNOs synthetisiert. PQS und HQNO tragen ganz wesentlich zur Virulenz und Konkurrenzfähigkeit von P. aeruginosa bei. Die Charakterisierung der Aktivitäten und Interaktionen der Enzyme des verzweigten Synthesewegs wird dazu beitragen zu verstehen, wie P. aeruginosa durch Feinabstimmung der Produktion verschiedener Sekundärmetaboliten seine biotische Umgebung beeinflusst. Zudem kann das Verständnis der Enzymeigenschaften zur Entwicklung antivirulent wirkender Stoffe beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen