Hochleistungs-LC/MS-Plattform für die Proteomik: Teil 1 "Discovery"
Final Report Abstract
Das UHPLC-LTQ Orbitrap Velos System, ausgestattet mit „Electron-Transfer-Dissociation“ (ETD), wurde im Rahmen mehrerer Forschungsprojekte intensiv und entsprechend seiner Leistungsklasse genutzt. Es war somit wesentlicher Bestandteil der Arbeiten, die in der Arbeitsgruppe „Funktionelle Proteomik“ durchgeführt wurden. Das Forschungsgroßgerät hat zudem einen wesentlichen Beitrag zum Forschungsprogramm des Exzellenzclusters BIOSS Centre for Biological Signalling Studies geleistet und eine Vielzahl von Kooperationsarbeiten ermöglicht. Im Folgenden werden exemplarisch nur einige der wichtigsten Forschungsergebnisse und wissenschaftlichen Arbeiten dargestellt, für die das System essentiell war. Ein wesentlicher Teil der Arbeiten fokussiert sich auf die Erforschung der Funktion und Biogenese von Mitochondrien im eukaryotischen Modellsystem Saccharomyces cerevisiae sowie in humanen Zellen und dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei, dem Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit beim Menschen. Mitochondrien, die allgemein als "Kraftwerke der Zelle" bekannt sind, benötigen ca. tausend verschiedene Proteine, um ihre vielfältigen Funktionen wie z.B. die Generierung von ATP erfüllen zu können. Die Mehrzahl der mitochondrialen Proteine ist Kern-kodiert und muss nach ihrer Synthese im Zytosol in die Mitochondrien importiert werden. Ist der Import mitochondrialer Proteine jedoch gestört, kommt es zu schwerwiegenden Fehlfunktionen der Mitochondrien, wobei mitochondriale Vorläuferproteine im Zytosol verbleiben. Um spezifische Stressantworten der Zelle zu bestimmen, erfolgten umfangreiche MS- basierte quantitative Proteomanalysen von Zellen mit einem gestörten mitochondrialen Proteinimport versus Wildtyp-Zellen. Auf Basis der quantitativen Proteomdaten konnte erstmalig ein Mechanismus identifiziert werden, der die Zelle davor schützt, dass mitochondriale Vorläuferproteine im Zytosol akkumulieren. Der Mechanismus „Unfolded Protein Response activated by mistargeting of proteins (UPRam)“ beinhaltet zwei Hauptwege: (1) Hemmung der Proteinsynthese im Zytosol und (2) Aktivierung des Proteasom, um so mitochondriale Vorläuferproteine im Zytosol effektiv abzubauen. In einer weiterführenden Studie wurde basierend auf quantitativen MS-Analysen eine neue Methode entwickelt, mit der das mitochondriale „Importom“, d.h. die Gesamtheit der aus dem Zytosol importierten mitochondrialen Proteine, umfassend bestimmt wurde, einschließlich dual-lokalisierter Proteine. Mittels ImportOmics konnten 1,120 mitochondriale Proteine, darunter mehr als 300 neue Proteine, in dem Parasiten T. brucei identifiziert werden. ImportOmics ermöglicht zudem die systematische Charakterisierung verschiedener Proteinimportsysteme in Mitochondrien sowie in anderen Organellen, wie z.B. Peroxisomen. Das System war weiterhin essentiell für die Durchführung der bisher umfangreichsten Charakterisierung des mitochondrialen Proteoms in S. cerevisae auf Basis relativ and absolut quantitativer MS-Analysen. Diese integrative, funktionelle Proteomanalyse von Mitochondrien und assozierten Fraktionen ermöglichte die Klassifizierung von mehr als 3.300 Proteinen, die Definition eines mitochondrialen Proteoms mit sehr hoher Konfidenz, die quantitative Bestimmung mitochondrialer Proteine und ihrer Dynamik unter verschiedenen Bedingungen sowie Aussagen zur submitochondrialen Lokalisation und Membrantopologie mitochondrialer Proteine. Es konnten zahlreiche neue mitochondriale Proteine identifiziert werden, deren potentielle Funktionen mittels Interaktionsstudien weiter untersucht wurden. Hochsensitive Interaktionsstudien von Membranproteinen mittels Affinitätsaufreinigung und quantitativer MS waren auch von zentraler Bedeutung für unsere Arbeiten zur Koordination von mitochondrialer Proteinsynthese und Proteinimport sowie zur Beschreibung eines neuen Typs einer mitochondrialen Proteintranslokase in T. brucei. Ein weiterer Teil der Arbeiten, in dem das LC-MS System maßgeblich eingesetzt wurde, fokussierte sich auf strukturelle Untersuchungen von Proteinkomplexen mittels Protein-Crosslinking und hochauflösender MS. Zur Untersuchung des peroxisomalen Proteinimports auf molekularer Ebene haben wir UV-Licht-induziertes Crosslinking in Kombination mit MS eingesetzt. Unsere Daten waren die Grundlage für die Beschreibung eines zweistufigen Mechanismus der Substraterkennung am peroxisomalen Importrezeptor Pex5p. In einer Studie zur Interaktion des bakteriellen SRP-Rezeptors mit dem SecYEG-Translokon konnten erstmalig in vivo durch UV-Crosslinking vernetzte Peptide massenspektrometrisch identifiziert und daraus molekulare Kontaktstellen abgeleitet werden. Im Rahmen von proteomischen Studien zur Aufklärung biologischer Signalwege wurden insbesondere die unterschiedlichen Fragmentierungstechniken einschließlich ETD am Orbitrap Elite Gerät genutzt, um in vivo Phosphorylierungsstellen in Proteinen mit hoher Sensitivität und Genauigkeit zu identifizieren. Die Studien fokussierten sich auf die myofibrilläre Z-Scheibe, die eine zentrale Rolle bei Signaltransduktionsprozessen im Muskel spielt, und insbesondere auf das Z-Scheiben-assoziierte Aktin-bindende Protein Filamin C. Mutationen im Filamin C-Gen führen zu Filaminopathie, welches eine spezifische Form der myofibrillären Muskelerkrankungen darstellt. Umfangreiche Phosphoproteomanalysen von kontrahierenden Myotuben zeigten, dass die myofibrilläre Z-Scheibe ein Proteinphosphorylierungshotspot und Filamin C ein Substrat der Proteinkinase PKCα in seiner zweiten Scharnierregion ist. Diese PKCα-vermittelte Phosphorylierung schützt Filamin C vor Spaltung durch die Cysteinprotease Calpain 1. Durch Spaltung verkürztes Filamin C zeigte eine überaus schnelle Kinetik und Mobilität, so dass reversible Phosphorylierung einen Mechanismus zur Regulation der FLNc-Dynamik bereitstellt.
Publications
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