Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy for Metal Ion Quantitation
Final Report Abstract
Erhöhte Konzentrationen des zweiwertigen Kupferions Cu2+ werden in Zusammenhang mit neurodegenerativen Krankheiten diskutiert und erfordern deshalb einen spezifischen, quantitativen Nachweis in nanomolaren Konzentrationen oder darunter. Im Rahmen des Projektes wurde ein BODIPY-markiertes Tetrapeptid mit einem ATCUN-Motiv synthetisiert und charakterisiert, das selektiv Cu2+ mit einer Dissoziationskonstante KDiss = 10-13 M bindet. Die Bindung von Cu2+ führt zu einer Reduktion der Fluoreszenzlebensdauer von 5.7 ns auf 0.5 ns, was auf Energietransfer auf den stark gefärbten Cu-Indikator-Komplex zurückgeführt werden kann. Beide Spezies können durch Fluoreszenzlebensdauerkorrelationsspektroskopie (FLCS) nachgewiesen und quantifiziert werden. FLCS wurde etabliert und verwendet, um die molecular brigthness von dimeren Fluoreszenzproteinen frei von Untergrund zu bestimmen. Als nach unten limitierend für den zugänglichen Konzentrationsbereich in der Cu2+-Titration zeigt sich einerseits die kurze Lebensdauerkomponente im synthetischen Konstrukt, die vom Streusignal nicht unterschieden werden kann. Andererseits begrenzt eine Cu2+-unempfindliche Verunreinigung (Reinheit des Sensors: ca. 95%) die Quantifizierung von Cu2+ nach oben. Für die Anwendung in Zellkulturen kommt noch hinzu, dass das geladene Peptid die Zellmembran nicht überwindet und zusätzlich Autofluoreszenz die mit der kurzen Lebensdauer einhergehende dunklere Komponente überdeckt. Für den qualitativen intrazellulären, mikroskopischen Nachweis von freiem Cu2+ erscheinen deshalb gelb/orange fluoreszierende Proteine mit DAHK-Sequenz geeignet.
Publications
- Rational Structure-Based Design of Bright GFP-Based Complexes with Tunable Dimerization, Angew. Chem. 127 (2015), 14158-14162. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (2015), 14158-14162
M. Eshaghi, G. Sun, A. Grüter, C.L. Lim, Y. Chee, G. Jung, R. Jauch, Th. Wohland, S. Chen
(See online at https://doi.org/10.1002/anie.201506686)
