A possible interaction with a periplasmatic Aldo-Keto-Reductase indicates a new physiological function of bacterial nucleotide transporters
Anatomy and Physiology
Biochemistry
Microbial Ecology and Applied Microbiology
Final Report Abstract
Obligat intrazelluläre, parasitische Bakterien besitzen meist einen sehr eingeschränkten Stoffwechsel und können viele Moleküle nicht eigenständig synthetisieren. Um zu überleben, müssen sie deshalb beispielsweise Energie, DNA- und RNA-Bausteine mittels sogenannter Nukleotid-Transporter (NTTs) aus ihren Wirtszellen importieren. NTTs wurden kürzlich auch in einigen freilebenden Bakterien entdeckt. Da diese Bakterien Nukleotide selber herstellen können und in ihrer Umgebung kaum mit Nukleotiden in Berührung kommen, war nicht klar, wofür sie diese Transporter brauchen. Genomanalysen, phylogenetische Studien und Computervorhersagen deuteten auf eine mögliche Interaktion der NTTs mit einer Aldo/Keto-Reduktase (AKR) hin. In dieser Studie wollten wir diese Vermutung überprüfen und erste Einblicke in die Funktion von NTTs in freilebenden Bakterien erhalten. Zunächst produzierten wir AKRs aus zwei unterschiedlichen Bodenbakterien im heterologen Wirt E. coli. Die AKR aus dem gamma-Proteobakterium Pseudomonas putida wurde gereinigt und es konnten hiermit erfolgreich AKR-spezifische Antiseren produziert werden. Die AKR scheint aber nur in sehr geringen Mengen in P. putida vorzuliegen, so dass sie mit dem Antikörper nicht detektiert werden konnte. Die Substrate der AKR konnten bislang noch nicht identifiziert werden. Entweder ist das gereinigte Enzym nicht funktionell oder die Substrate waren nicht unter den getesteten Zuckern und Zuckeralkoholen. Weitere potentielle Substrate sollen im Rahmen von Bachelorarbeiten in Enzymtests geprüft werden. Uns ist es gelungen Mutanten von P. putida herzustellen, deren AKR durch die Insertion einer Kanamyzin-Resistenz geschädigt ist. Diese Mutanten zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress und Membran-schädigenden Substanzen sowie eine gesteigerte Resistenz gegen die Antibiotika Nafcillin und Enoxazin. Überdies konnte im Vergleich zum Wildtyp ein verbessertes Wachstum auf Pyruvat- und Essigsäure-haltigen Medien ermittelt werden. Viele dieser Beobachtungen deuten auf Veränderungen im Kohlenhydratstoffwechsel hin: Über den Entner- Doudoroff-Weg wird nicht nur Glucose abgebaut sondern werden auch Reduktionsäquivalente gebildet. Dieser Stoffwechselweg ist bei P. putida stark favorisiert und bedingt dessen hohe Toleranz gegenüber oxidativem Stress. Eine Misregulation dieses Stoffwechsels führt demnach zu einer stärkeren Empfindlichkeit gegenüber Substanzen, die oxidativen Stress auslösen. Zudem können auch intern reaktive Sauerstoffspezies schlechter abgebaut werden und akkumulieren. Dieses wiederum kann zu Stress an der Plasmamembran der Bakterien beitragen und entsprechende Antworten, wie erhöhte Resistenz gegen Antibiotika oder Empfindlichkeit gegenüber Membranschädigenden Substanzen auslösen. Auch das gesteigerte Wachstum auf bestimmten Kohlenhydraten ist ein Indiz für einen veränderten Kohlenhydrat-Metabolismus. Es ist ebenfalls gelungen Mutanten mit einer erhöhten Menge an AKR und NTT zu generieren. Erste Analysen zeigen, dass auch diese unter oxidativem Stress leiden. Extrazelluläre Nukleotide wurden kürzlich als mögliche Signalmoleküle in Bakterien beschrieben. Es bleibt zu klären, ob der NTT und die AKR zu einer Regulierung des extrazellulären Nukleotid-Pools beitragen und dadurch oxidativem Stress entgegenwirken. Für die entsprechenden weiterführenden Versuche bilden die Mutanten eine wichtige Grundlage. Es war überraschenderweise nicht möglich den NTT des akr/ntt Operons auszuschalten. Es ist durchaus vorstellbar, dass die Funktion des NTT essentiell für das Überleben von Pseudomonas ist. In Kooperation mit Prof. U. Bonas (University Halle), Prof. S. Schmitz-Esser (Iowa State University, USA), Prof. H.E. Neuhaus (TU Kaiserslautern) and Prof. S. Sonnewald (University Erlangen) wurden allerdings Deletions- und Überexpressions-Mutanten des NTT in Xanthomonas pv. vesicatoria (Xcv) generiert und untersucht. Im Gegensatz zu allen anderen freilebenden Bakterien fehlt den Xanthomonaden allerdings die entsprechende AKR-Sequenz. Xcv ist ein freilebendes, phytophathogenes Gamma-Proteobakterium, welches die Blattfleckenkrankheit in Paprika und Tomate auslöst. Die biochemischen Daten und Pflanzeninfektionsstudien zeigen, dass der NTT eine wichtige Rolle bei der Interaktion des Bakteriums mit der Pflanze einnimmt. Die entsprechenden Resultate sind in einem Manuskript zusammengefasst. Im Rahmen des gesamten Projektes erhielten wir erste Einblicke in die Funktion der Nukleotid-Transporter aus freilebenden Bakterien und ein großer Durchbruch ist sicherlich auch, dass erstmalig die biochemische Funktion einzelner NTTs im nativen System bestimmt werden konnte.
