Regulation der TNF-Biosynthese durch MK2/3: Die Rolle der MK2/3-abhängigen Expression von TTP und seine Wechselwirkung mit weiteren ARE-bindenden Proteinen und Ko-Faktoren

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Gaestel
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 227410360

TNF ist ein zentrales Zytokin der Entzündungsantwort von Makrophagen. Seine Biosynthese unterliegt strenger regulatorischer Kontrolle, um seine schnelle Sekretion zu ermöglichen, aber auch um eine Verzögerung beim Abschalten der Entzündungsantwort zu vermeiden, welche zu einer verstärkten oder chronischen Entzündung führen könnte. Diese Regulation umfasst die Ebenen der Transkription, der mRNA-Prozessierung, den Kernexport und die Stabilität der mRNA, sowie die pro-TNF-Translation, den Transport zur und die proteolytische Freisetzung an der Zellmembran. Der p38 MAPK/MK2/3-Signalweg reguliert die TNF-Biosynthese translational in Abhängigkeit vom AU-reichen Element (ARE) in der 3‘-UTR der TNF mRNA, welches verschiedene Substrate von p38 und MK2 binden kann (z.B. hnRNP A0, tristetraprolin (TTP) und KSRP). Bisher wird der molekulare Mechanismus, der die ARE-abhängige Translation von pro-TNF durch signalabhängige Phosphorylierung steuert, nicht verstanden. Das ARE-bindende MK2-Substrat TTP wird bisher hauptsächlich für die Regulation der Stabilität spezifischer mRNAs verantwortlich gemacht. Wir haben Makrophagen generiert, welche den MK2/3-defizienten und MK2-wiederhergestellten Ge-notyp besitzen, und haben in diesen eine TTP- und MK2-abhängige Translation von TNF- und TTP-mRNA nachweisen können. Weiterhin konnten wir eine transkriptionelle Regulation des TTP-Gens durch SRF nachweisen und den SRF-Kofaktor MRTF-A (MAL, MKL1) als Substrat von MK2 identifi-zieren. Darüber hinaus konnten wir Komponenten des Proteasoms als Substrat von MK2 bzw. Wech-selwirkungspartner von TTP nachweisen. Aufbauend auf diesen Vorarbeiten soll das vorgeschlagene Projekt die Aufklärung der molekularen Mechanismen der p38/MK2/3-abhängigen Translationskontrolle der TNF-Biosynthese verfolgen. Dabei soll insbesondere die Rolle von TTP und weiteren ARE-bindenden Proteinen und die Regulation ihrer Expression und Aktivität untersucht werden. Zusätzlich wollen wir den Einfluss von TTP auf den regulierten Abbau spezifischer mRNAs genauer untersuchen.Die Identifikation und Charakterisierung von Komponenten, welche die MK2- und TTP-abhängige Translation beeinflussen, umfasst die Analyse ihrer Verteilung in subzellulären Polysomenprofilen und den Einfluss des knockdown dieser Komponenten auf die Translation von TNF- und TTP-mRNA. Die Effekte dieser Komponenten auf die Cap-abhängige Translation und die ARE-Bindung von TTP sollen in Reporter- und Bindungsassays analysiert werden. Die Rolle der spezifischen Phosphorylierungen von TTP soll mittels rescue-Versuchen mit TTP-Phosphorylierungsmutanten in TTP-defizienten Mak-rophagen erfolgen. Darüber hinaus werden weitere biochemische und genetische Analysen der Regu-lation von TTP-Expression, -Modifikation und des -Abbaus erfolgen.Die Bearbeitung des Projektes wird das Verständnis wesentlicher Mechanismen und Prinzipien der posttranskriptionellen Genexpression bei der Entzündung ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen