Spinning Disk Live Cell Confocal Imaging Mikroskop
Final Report Abstract
Proteine, mRNAs und Organellen werden innerhalb von Zellen entlang von Zytoskelettelementen transportiert. An diesen Prozessen sind molekulare Motoren beteiligt, die unter ATP-Verbrauch bestimmte Transportgüter durch die Zelle befördern. Während das Mikotubuli-Zytoskelett überwiegend Langstreckentransport vermittelt, sind Aktinfilamente oft für lokalen Transport unterhalb der Plasmamembran verantwortlich. Das Projekt untersucht dynamische Prozesse in Nervenzellen, die in Zusammenhang mit neuronaler Plastizität stehen. Es werden Myosin, Kinesin und Dynein Motorproteine sowie deren Cargo-Adaptoren und Transportgüter untersucht, die in Abhängigkeit von synaptischer Aktivität an die Synapse befördert werden bzw. aus der Synapse entfernt werden. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf Neurotransmitter-Rezeptoren, die die synaptische Transmission an chemischen Synapsen vermitteln. Die Regulation von Transport erfolgt auf Ebene der Motor-Cargo-Komplexe, sowie auf Ebene der Mikrotubuli. Innerhalb dieses Projektes werden Mausmodelle untersucht, bei denen Motoren genetisch ausgeschaltet waren, die Mikrotubuli-Bausteine Tubulin mutiert waren (Verhinderung posttranslationaler Modifikationen), bzw. Mikrotubuli-manipulierende Enzyme (MT-Severing) depletiert wurden. Das Spinning Disk Mikroskop erlaubt eine sehr schnelle zeitaufgelöste Visualisierung von Transportprozessen in lebenden Zellen. Wir haben hierbei kultivierte hippokampale Neuronen verwendet, die flach auf einer Glasoberfläche auflagen. Darüber hinaus wurden mit Hilfe der FRAP-Einheit (Fluorescent recovery After Photobleaching) einzelne fluoreszierende Bereiche von GFP-Fusionsproteinen in Nervenzellen ausgebleicht. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz innerhalb der gebleichten Regionen ist ein Maß für die Beweglichkeit von Molekülen. Auf diese Weise wird der Eintritt von pHluorin-markierten Rezeptoren in die Plasmamembran zeitaufgelöst visualisiert. Aus Mitteln der Universität wurde das Mikroskop mit einer TIRF-Einheit aufgerüstet, so dass auch dynamische Prozesse in unmittelbarer Nähe zur Zelloberfläche erfasst werden können. Wichtige Ergebnisse aus diesen Experimenten beinhalten die Untersuchung des Kinesins KIF21B, dessen Gen ursprünglich als Risikogen für Multiple Sklerose identifiziert wurde. Wir konnten zeigen, dass dieser Motor sowohl synaptische Proteine in Richtung Synapse transportiert, als auch die Dynamik von Mikrotubuli reguliert. Eine knockout-Maus, bei der die Genexpression von KIF21B unterbunden ist, zeigt starke Defizite in der Morphologie von Dendriten und synaptischen Spines und ist in Lern- und Gedächtnistests beeinträchtigt. KIF21B ist unter anderem verantwortlich um GABA-A Rezeptoren an die Plasmamembran zu befördern und wird selbst durch die E3-Ligase Trim-3 reguliert, welche ebenfalls für den Transport von mRNA-Partikeln verantwortlich ist. Ein anderer klassischer Motor in Nervenzellen ist das Kinesin KIF5, welches AMPA Rezeptoren in die Spine-Synapse befördert. Wir konnten zeigen, dass der Cargo Adapter GRIP1, der KIF5 mit AMPA-Rezeptoren koppelt, ein wichtiger Regulator für die Belieferung glutamaterger Synapsen ist. GRIP1 besitzt sieben PDZ-Domänen, von denen neben der Bindung an AMPA-Rezeptoren eine Bindung an N-Cadherin vermittelt wird. GRIP1 reguliert den Cotransport beider synaptischer Faktoren und befördert diese Proteine zwischen dem Golgi-Apparat und der Zelloberfläche. KIF5 ist ebenfalls ein wichtiger Faktor im Transport des postsynaptischen Proteins Gephyrin. Neben aktivem Transport haben wir die Diffusion von GABA-A Rezeptoren in der Plasmamembran untersucht. Der Rezeptoranker Radixin vermittelt, ob Rezeptoren die postsynaptische Spezialisierung erreichen oder von dort ferngehalten werden. Diese Ergebnisse wurden im Zusammenhang der Literatur in Übersichtsartikeln diskutiert und zusammengefasst. Darüber hinaus wurde das Gerät für mehrere Kollaborationen eingesetzt, bei denen dynamische Prozesse eine Rolle spielten.
Publications
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