Spinning Disk Live Cell Confocal Imaging Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Proteine, mRNAs und Organellen werden innerhalb von Zellen entlang von Zytoskelettelementen transportiert. An diesen Prozessen sind molekulare Motoren beteiligt, die unter ATP-Verbrauch bestimmte Transportgüter durch die Zelle befördern. Während das Mikotubuli-Zytoskelett überwiegend Langstreckentransport vermittelt, sind Aktinfilamente oft für lokalen Transport unterhalb der Plasmamembran verantwortlich. Das Projekt untersucht dynamische Prozesse in Nervenzellen, die in Zusammenhang mit neuronaler Plastizität stehen. Es werden Myosin, Kinesin und Dynein Motorproteine sowie deren Cargo-Adaptoren und Transportgüter untersucht, die in Abhängigkeit von synaptischer Aktivität an die Synapse befördert werden bzw. aus der Synapse entfernt werden. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf Neurotransmitter-Rezeptoren, die die synaptische Transmission an chemischen Synapsen vermitteln. Die Regulation von Transport erfolgt auf Ebene der Motor-Cargo-Komplexe, sowie auf Ebene der Mikrotubuli. Innerhalb dieses Projektes werden Mausmodelle untersucht, bei denen Motoren genetisch ausgeschaltet waren, die Mikrotubuli-Bausteine Tubulin mutiert waren (Verhinderung posttranslationaler Modifikationen), bzw. Mikrotubuli-manipulierende Enzyme (MT-Severing) depletiert wurden. Das Spinning Disk Mikroskop erlaubt eine sehr schnelle zeitaufgelöste Visualisierung von Transportprozessen in lebenden Zellen. Wir haben hierbei kultivierte hippokampale Neuronen verwendet, die flach auf einer Glasoberfläche auflagen. Darüber hinaus wurden mit Hilfe der FRAP-Einheit (Fluorescent recovery After Photobleaching) einzelne fluoreszierende Bereiche von GFP-Fusionsproteinen in Nervenzellen ausgebleicht. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz innerhalb der gebleichten Regionen ist ein Maß für die Beweglichkeit von Molekülen. Auf diese Weise wird der Eintritt von pHluorin-markierten Rezeptoren in die Plasmamembran zeitaufgelöst visualisiert. Aus Mitteln der Universität wurde das Mikroskop mit einer TIRF-Einheit aufgerüstet, so dass auch dynamische Prozesse in unmittelbarer Nähe zur Zelloberfläche erfasst werden können. Wichtige Ergebnisse aus diesen Experimenten beinhalten die Untersuchung des Kinesins KIF21B, dessen Gen ursprünglich als Risikogen für Multiple Sklerose identifiziert wurde. Wir konnten zeigen, dass dieser Motor sowohl synaptische Proteine in Richtung Synapse transportiert, als auch die Dynamik von Mikrotubuli reguliert. Eine knockout-Maus, bei der die Genexpression von KIF21B unterbunden ist, zeigt starke Defizite in der Morphologie von Dendriten und synaptischen Spines und ist in Lern- und Gedächtnistests beeinträchtigt. KIF21B ist unter anderem verantwortlich um GABA-A Rezeptoren an die Plasmamembran zu befördern und wird selbst durch die E3-Ligase Trim-3 reguliert, welche ebenfalls für den Transport von mRNA-Partikeln verantwortlich ist. Ein anderer klassischer Motor in Nervenzellen ist das Kinesin KIF5, welches AMPA Rezeptoren in die Spine-Synapse befördert. Wir konnten zeigen, dass der Cargo Adapter GRIP1, der KIF5 mit AMPA-Rezeptoren koppelt, ein wichtiger Regulator für die Belieferung glutamaterger Synapsen ist. GRIP1 besitzt sieben PDZ-Domänen, von denen neben der Bindung an AMPA-Rezeptoren eine Bindung an N-Cadherin vermittelt wird. GRIP1 reguliert den Cotransport beider synaptischer Faktoren und befördert diese Proteine zwischen dem Golgi-Apparat und der Zelloberfläche. KIF5 ist ebenfalls ein wichtiger Faktor im Transport des postsynaptischen Proteins Gephyrin. Neben aktivem Transport haben wir die Diffusion von GABA-A Rezeptoren in der Plasmamembran untersucht. Der Rezeptoranker Radixin vermittelt, ob Rezeptoren die postsynaptische Spezialisierung erreichen oder von dort ferngehalten werden. Diese Ergebnisse wurden im Zusammenhang der Literatur in Übersichtsartikeln diskutiert und zusammengefasst. Darüber hinaus wurde das Gerät für mehrere Kollaborationen eingesetzt, bei denen dynamische Prozesse eine Rolle spielten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics. Nat Rev Neurosci. 2013 Apr;14(4):233-47
Kneussel M, Wagner W
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GRIP1 interlinks N-cadherin and AMPA receptors at vesicles to promote combined cargo transport into dendrites. Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Apr 1;111(13):5030-5
Heisler et al. … Kneussel, M.
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Molecular basis of the alternative recruitment of GABA(A) versus glycine receptors through gephyrin. Nat Commun. 2014 Dec 22;5:5767
Maric et al.
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SnapShot: receptor dynamics at plastic synapses. Cell. 2014 Jun 19;157(7):1738-1738.e1
Kneussel M, Triller A, Choquet D.
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Radixin regulates synaptic GABAA receptor density and is essential for reversal learning and short-term memory. Nat Commun. 2015 Apr 20;6:6872
Hausrat, et al. … Kneussel, M.
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The LisH motif of muskelin is crucial for oligomerization and governs intracellular localization. Structure. 2015 Feb 3;23(2):364-73
Delto et al.
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Ubiquitin ligase TRIM3 controls hippocampal plasticity and learning by regulating synaptic gamma-actin levels. J Cell Biol. 2015 Nov 9;211(3):569-86
Schreiber et al.
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Postsynaptic Neurotransmitter Receptor Reserve Pools for Synaptic Potentiation. Trends Neurosci. 2016 Mar;39(3):170-82
Kneussel M, Hausrat
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Synaptic recruitment of gephyrin regulates surface GABAA receptor dynamics for the expression of inhibitory LTP. Nat Commun. 2014 Jun 4;5:3921
Petrini et.al.
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The Kinesin KIF21B Regulates Microtubule Dynamics and Is Essential for Neuronal Morphology, Synapse Function, and Learning and Memory. Cell Rep. 2016 May 3;15(5):968-77
Muhia et al. ... Kneussel, M.
