Formation of ellagic acid precursors in Fragaria

• Applicant: Professor Dr. Wilfried Schwab
• Subject Area: Plant Physiology
• Term: from 2012 to 2016
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 224621359

• Final Report Year: 2016

Final Report Abstract

Erdbeeren enthalten große Mengen bioaktiver Polyphenole, u.a. Ellagsäure und Ellagitannine. Ellagsäure und Ellagitannine sind wirksam gegen menschliche Gesundheitsrisiken, wie kardiovaskuläre und neurodegenerative Krankheiten und können vor hormonellen Krebsarten wie Prostata- und Brustkrebs schützen. Zudem zeigen Ellagitannine eine starke, antimikrobielle Wirkung gegenüber Bakterien, Hefen und Viren und dienen damit der natürlichen Abwehr gegen eine Reihe mikrobieller Infektionen. Obwohl die biologische Bedeutung dieser Verbindungen mehrfach bestätigt wurde, ist der Biosyntheseweg nicht vollständig aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher die Struktur und Funktion von Genen und Enzymen zu identifizieren, die zur Bildung bzw. zur Akkumulierung von Ellagsäure/Ellagitanninen in der Erdbeere beitragen. Das erste intermediäre Produkt des Ellagsäure–Biosyntheseweges ist β-Glucogallin. Es wird durch UDP-Glucose Glucosyltransferasen (UGTs) katalysiert, die je ein Molekül Gallussäure und UDP-Glucose verestern. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf UGTs aus Walderdbeere (FvGT2), Gartenerdbeere (FaGT2, FaGT2* und FaGT5) und Himbeere (RiGT2) identifiziert und charakterisiert, die die Bildung von β-Glucogallin katalysieren. Die Enzyme bildeten Glucose-Ester von verschiedenen Hydroxybenzoeund Hydroxyzimtsäuren und zeigten somit eine promiskuitive Aktivität. Positionsgerichtete Mutagenese der Proteinsequenz und die Bestimmung der kinetischen Konstanten offenbarten Aminosäuren, die die Substrat-Präferenz und katalytische Aktivität maßgeblich beeinflussten. Grüne, unreife Erdbeerfrüchte konnten als Hauptquelle für Gallussäure, β-Glucogallin und Ellagsäure identifiziert werden. Die Expressionslevel der Gallat-UGTs korrelierten mit der Akkumulierung der Ellagitannin- Vorläufermoleküle in grünen, unreifen Früchten. Durch Injektion stabil isotopenmarkierter Gallussäure in grüne Früchte FaGT2-defizienter Erdbeerpflanzen konnte die in planta Funktion der UGTs bestätigt werden. Auf die Veresterung von Gallussäure und UDP-Glucose zu β-Glucogallin, folgen weitere Galloylierungen zu Di- und Trigalloylglucose bis hin zu 1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose, dem vermuteten Vorläufer von Ellagitanninen und Gallotanninen. Die Galloylierungen werden vermutlich durch „serine carboxypeptidase-like“ (SCPL) Proteine katalysiert, die Acyltransferase-Aktivität besitzen können. Da die Konzentration der Vorläufer-Moleküle in unreifen Früchten am höchsten ist und zu reifen Früchten hin immer weiter abnimmt, könnte auch die Genexpression putativer Acyltransferasen zur Fruchtreife entgegengesetzt korreliert sein. Um die Transkript-Levels von Genen zu bestimmen, deren Expression während der Fruchtreife abnimmt, wurde RNA aus grünen, weißen und reifen Früchte dreier Walderdbeersorten isoliert und sequenziert (RNA-Seq). Die Gensequenzen bekannter Acyltransferasen wurden mit den Ergebnissen des RNA-Seq-Experiments verglichen und drei Kandidatengene identifiziert (AT1, 2 und 3). AT1 und 3 wurden zur in vitro und in vivo Charakterisierung in verschiedene Vektorsysteme kloniert. In vitro konnten die Enzyme aufgrund fehlender Expression im Wirtsorganismus Hefe nicht charakterisiert werden. Durch A. tumefaciens vermittelten Gentransfer konnte jedoch die Expression beider ATs in reifenden Erdbeerfrüchten hochreguliert werden. Isolierung und Quantifizierung der Sekundärmetabolite offenbarte eine erhöhte Ellagsäure-Konzentration. Diese Ergebnisse liefern einen ersten Hinweis auf die Funktion von AT1 und AT3 als Galloyltransferasen in planta. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die hier untersuchten UGTs und Acyltransferasen an der Produktion von Ellagsäure/Ellagitanninen beteiligt sein könnten.

Publications

• Biosynthese der Naturstoffe in Erdbeeren. GHL Symposium, Gewächshauslaborzentrum Dürnast Freising: 08.05.2013
  Franz K, Schulenburg K, Schwab W
  
• Formation of ellagic acid precursors in Fragaria. Deutsche Botanikertagung, Tübingen: 30.09.2013 – 04.10.2013
  Schulenburg K, Schwab W
  
• 2015. Functional characterization and substrate promiscuity of UGT71 glycosyltransferases from strawberry (Fragaria × ananassa). Plant and Cell Physiology 56, 2478–2493
  Song C, Gu L, Liu J, Zhao S, Hong X, Schulenburg K, Schwab W
  
• Transiente Überexpression von Acyltransferasen in F. × ananassa cv. Elsanta. GHL Symposium, Gewächshauslaborzentrum Dürnast Freising: 06.05.2015
  Schulenburg K, Schwab W
  
• What’s the difference between a white and a red strawberry? qPCR and NGS Symposium. Freising: 23.03.2015 – 27.03.2015
  Schulenburg K, Schwab W
  
• A UDP-glucosyltransferase functions in both acylphloroglucinol glucoside and anthocyanin biosynthesis in strawberry (Fragaria x ananassa). Plant Journal, 2016 Feb 9
  Song C, Zhao S, Hong X, Liu J, Schulenburg K, Schwab W
  
• Formation of β-glucogallin, the precursor of ellagic acid in strawberry and raspberry. Journal of Experimental Botany, 2016 Feb 16. pii: erw036 [Epub ahead of print]
  Schulenburg K, Feller A, Hoffmann T, Schecker JH, Martens S, Schwab W
  
• Glucosylation of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone, the key strawberry flavor compound in strawberry fruit. Plant Physiology, 2016 Mar 18. pii: pp.00226 [Epub ahead of print]
  Song C, Hong X, Zhao S, Liu J, Schulenburg K, Huang FC, Franz-Oberdorf K, Schwab W
  
• Plant glucosyltransferases for the biotechnological production of small molecule glucosides. Industrial Biotechnology Forum, Garching 14.03.2016 – 15.03.2016 (Gewinner des Poster-Preises der Veranstaltung)
  Schulenburg K, Huang F-C, Schwab W