Isothermes Titrationskalorimeter
Final Report Abstract
Biologische Prozesse beruhen auf molekularen Wechselwirkungen, welche zwischen allen Klassen von Makromolekülen auftreten und durch Wärmeänderungen begleitet sind. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) erlaubt derartige Veränderungen quantitativ zu erfassen und dabei Kenngrößen molekularer Wechselwirkungen wie die Änderung der Gibbs freien Energie, Enthalpie und Entropie zu bestimmen. Durch Titration der Reaktanten können die Assoziations-/Dissoziationskonstanten und Stöchiometerie-Verhältnisse im Bindungsgleichgewicht ermittelt werden. An der Antragstellung haben sich die Arbeitsgruppen um Prof. Schwarz (Hauptantragsteller), sowie Prof. Niefind, Dr. Praefcke und Dr. Lammers beteiligt. Das Gerät wurde zur Ergänzung des bereits vorhandenen VP-ITC angeschafft und sollte ein höheres Maß an Automatisierung bei gleichzeitiger Einsparung an Probenmaterial gewährleisten. In den ersten drei Jahren der Nutzung konnten durch alle Antragsteller erste Ergebnisse individuell und in Zusammenarbeit publiziert werden. Durch den Hauptantragsteller wurde die Nutzung des Auto-ITC in verschiedene Projekte geplant. Dazu gehörte die Wechselwirkung des postsynaptischen Strukturproteins Gephyrin mit zytoplasmatischen Domänen des GABA-Rezeptors, Identifizierung der verschieden affinen Bindungsstellen des Glycin-Rezeptors auf Gephyrin, Wechselwirkung mit Proteinen des Dynein Motorkomplex, Bindungsstudien mit phopshoryliertem Gephyrin und verschiedenen Spleissvarianten von Gephyrin, Bindungsstudien der Nitratreduktase und Glutaminsynthetase and 14-3-3 Proteine und Interaktionsstudien der Häm-Domäne in der Sulfitoxidase. Darüber hinaus sollte die Wechselwirkung mit den Peptidylproly cis/trans-Isomerasen im sogenannten kontinuierlichen enzymatischen Modus untersucht werden. Das Auto-ITC wurde hauptsächlich für die Charakterisierung der Wechselwirkung von Gephyrin mit verschiedenen Peptiden und Fusionsproteinen der zytosolischen Domänen des Glyzin- und GABAA-Rezeptors verwendet. Dabei wurden zum einen humanpathogene Varianten verwendet, zum anderen konnten verschiedene Bindungsstellen im Glyzin-Rezeptor identifiziert und charakterisiert werden. Ferner wurde ein neuartiges Expressionssystem für die Assemblierung pentamerer Strukturen der zytoplasmatischen Rezeptordomänen entwickelt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften untersucht. Diese Studien erklären erstmals auf molekularer Ebene die Funktion von Gephyrin bei der Clusterung inhibitorischer Rezeptoren und erlauben das Zusammenspiel verschiedener GABAA-Rezeptor-Untereinheiten zu untersuchen. Die Wechselwrikung von Gepyhrin mit einer leichten Kette des Dynein Motorkomplexes wurde ebenfalls mittels Auto-ITC quantifiziert. Hier liegt die molekulare Funktion der Interaktion in der Regulation der Nitrosylierung von Gephyrin durch die neuronal NO Synthase begründet. Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Domänen von Molybdänenzymen konnten mittels ITC nicht bestimmt werden. Neben der Forschung wurde das Auto-ITC in der Lehre in den Masterstudiengängen Biological Sciences und Chemsitry eingesetzt.
Publications
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