Identification of novel regulators of stem cell self-renewal in the larval Drosophila CNS
Final Report Abstract
Ausgangsfragestellung der geförderten Projekte war es neue genetische Faktoren der neuralen Stammzellproliferationskontrolle zu finden. In meiner Postdoc Phase habe ich zum ersten Mal eine zell-spezifische Transkriptomsanalyse von FACS aufgereinigten NBs vorgenommen. Aus dieser Analyse ging eine vielversprechende Liste an Kandidatengenen hervor, die Grundlage der beantragten Projekte war. Erste Analysen zeigten allerdings, dass die meisten dieser Gene einen ähnlichen Phänotyp nach Mutation zeigten und fast alle stellten sich als Myc-Zielgene heraus. Zeitgleich wurden zwei Artikel in Cell veröffentlicht, die zeigten, dass c-MYC als globaler transkriptioneller Amplifikator fungiert. Da unsere anfänglichen Untersuchungen ähnliche Ergebnisse zeigten, fanden wir diese Richtung nicht weiter ergiebig und schwenkten mit den Projekten in einer andere Richtung. Retrospektiv betrachtet war dies eine sehr erfolgreiche Entscheidung. Im ersten Projekt konnten wir zeigen, dass der Hippo Signalweg die Ruhephase von Drosophila neuralen Stammzellen aufrecht hält. Mutation der Singalwegskomponenten führt zu einem verfrühten Zellwachstum und Reaktivierung der Stammzellen. Weiterhin konnten wir zeigen, dass dies über den transkriptionellen Regulator Yorkie geschieht, der zum Beispiel als Zielgen die bantam microRNA anschaltet. bantam und Yorkie sind beide notwendig und ausreichend Zellwachstum und Reaktivierung in neuralen Stammzellen anzuschalten. Schließlich konnten wir zeigen, dass die Aktivität des Hippo Signalwegs über Zell-Zell Interaktion zwischen Nischengliazellen und den neuralen Stammzellen über die Proteine Echinoid und Crumbs reguliert wird. Diese Arbeit wurde in Nature Communication veröffentlicht. Im zweiten Projekt haben wir uns die Funktion des Steroid Signalwegs in der Reaktivierung von neuralen Stammzellen in Drosophila angeschaut. Unterbleibt der Signalweg, so können NBs nicht reaktiviert werden. Wir konnten zeigen, dass dies zell-autonom durch den EcRB2 Isoform in neuralen Stammzellen erfolgt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der bereits veröffentlichte Insulin-Signalweg unterhalb des InR in neuralen Stammzellen ohne Ecdyson Signalweg unterbrochen ist. Transkriptomsanalysen konnten bisher allerdings noch keine Kandidatengene ermitteln, die direkt für diesen Phänotyp verantwortlich gemacht werden können. Im weiteren haben wir untersucht, wie der EcR Genexpression in ruhenden neuralen Stammzellen regulieren könnten. Hier konnten wir die KDM4A/B Histondemethylasen als Interaktoren identifizieren, die spezifisch H3K9Me3 entfernen. Mutation von KDM4A/B phenokopiert den EcR. Weiterhin konnten immunhistochemische Analysen mit einem Antikörper gegen H3K9Me3 zeigen, dass neurale Stammzellen in der Ruhphase ein starkes Methylierungsmuster zeigen, dass nach Reaktivierung aufgelöst ist. Dies unterbleibt sowohl in EcR als auch in KDM4A/B Mutanten. Daher gehen wir davon aus, das EcR in der Ruhephase an geschlossene Chromatinbereiche bindet um nach Aktivierung die KDM4A/B Histondemethylase zu rekrutieren, die durch Demethylierung von Histon3 K9 Zielgene anschaltet wodurch Reaktivierung eingeleitet wird. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Methylierung von H3K9 durch Su-var3-9 und G9a notwendig ist um die Ruhephase in neuralen Stammzellen aufrecht zu erhalten. Somit konnten wir einen Zusammenhang zwischen dem Steroid Signalweg und der epigenetischen Regulation von Ruhephase und Reaktivierung in neuralen Stammzellen zeigen.
