Durchflusszytometer
Final Report Abstract
Etablierung einer durchflusszytometrischen Methode zur Mutagenitätsbestimmung anhand des GPI(-) Status in TK6-Zellen (AK Hartwig): Mutagenitätsbestimmungen in Säugerzellen sind zeit- und kostenintensiv. In unserem Arbeitskreis erstmals in Säugerzellkulturen eine Methode etabliert, die es ermöglicht, Mutationen in einem Gen, welches an der Biosynthese eines extrazellulären Ankerproteins beteiligt ist, durchflusszytometrisch zu quantifizieren. Konkret handelt es sich um GPI (Glykosylphosphatidylinositol), einen hoch konservierter Proteinanker an der Zelloberfläche eukaryotischer Zellen. An der GPI-Biosythese sind mindestens 22 unterschiedliche Gene beteiligt, die überwiegend als phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis (PIG) Gene bezeichnet werden. Eines davon, PIG-A, ist X-Chromosomal lokalisiert, so dass inaktivierende Mutationen zu einem GPI(-) Phänotyp der Zellen führen, der nach Antikörper-Färbung von GPI-verankerten Proteinen durchflusszytometrisch quantifiziert werden kann. Quantifizierung von Mikrokernen mittels Durchflusszytometrie (AK Hartwig): Der Mikrokerntest ist eine wichtige Methode im Rahmen der Genotoxizitätsbestimmungen von chemischen und physikalischen Agentien. Sie entstehen durch DNA- bzw. Chromosomenbrüche, die dazu führen, dass während der Mitose Chromatinfragmente oder komplette Chromosomen nicht vollständig von der Tochterzelle aufgenommen werden und eine separate Kernmembran erhalten. Mikrokerne sind somit chromatinhaltige, membranumschlossene Kernfragmente, die losgelöst vom Zellkern im Zytoplasma vorliegen. Die Auszählung von Mikrokernen erfolgt üblicherweise mikroskopisch, was allerdings mit großem zeitlichen Aufwand und subjektiver Beurteilung verbunden ist. Eine Alternative stellt die durchflusszytometrische Analyse dar. Diese erst in vergleichsweise wenigen Arbeiten in der Literatur beschriebene Methode wurde im AK Hartwig erfolgreich etabliert, wodurch die Auswertung von 20-30 Proben innerhalb einer Stunde mittels Durchflusszytometer möglich war. Ebenfalls gelang die Unterscheidung aneugener und klastogener Effekte anhand der Modellsubstanzen Etoposid, Mitomycin C, Diethylstilbestrol und Vinblastin. Die Methode soll durch Färbungen der Centromere noch weiter verfeinert werden. Hochdurchsatzprozessentwicklung für die markerfreie Aufreinigung von zellbasierten Produkten mittels wässriger Zweiphasensysteme (ATPS) (AK Hubbuch): Im Rahmen dieses Projekts wurde eine automatisierte und miniaturisierte Hochdursatzscreening Methode für die Entwicklung von Aufreinigungsprozessen mittels wässriger Zweiphasenextraktion für therapeutisch relevante Zellen etabliert. Die Analytik erfolgte mittels Hochdurchsatzdurchflusszytometrie. Im Rahmen des Projektes konnte gezeigt werden, dass Zellquantifizierung und Analytik (Antikörperanalytik, Zellzyklusanalytik, etc.) mittels Hochdurchsatzdurchflusszytometrie mit hoher Sensitivität, Selektivität und Präzision möglich sind.
Publications
- (2015) The in vitro PIG-A gene mutation assay: mutagenicity testing via flow cytometry based on the glycosylphosphatidylinositol (GPI) status of TK6 cells. Archives of Toxicology, 2429-2443
Krüger C. T., Hofmann M., Hartwig A.
(See online at https://doi.org/10.1007/s00204-014-1413-5) - Impact of cadmium on antioxidant enzymes in HCT116 cells and protective interaction by selenium. Perspective in Science, February 2015, 55
Risnes S. F., Hartwig A.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.pisc.2014.11.016) - Highthroughput cell quantification assays for use in cell purification development – Enabling technologies for cell production. Biotechnology Journal, May 2016, 676–686
Zimmermann S., Gretzinger S., Schwab M.-L., Scheeder C., Oelmeier S. A., Gottwald E., Hubbuch J.
(See online at https://doi.org/10.1002/biot.201500577) - The in vitro PIG-A gene mutation assay: glycosylphosphatidylinositol (GPI)-related genotype-to-phenotype relationship in TK6 cells. Archives of Toxicology, 21 April 2016
Krüger C. T., Bettina M. Fischer, Olivier Armant, Volker Morath, Uwe Strähle, Hartwig A
(See online at https://doi.org/10.1007/s00204-016-1707-x)
