Funktionelle Auswirkungen von Ryanodinrezeptormutationen auf die elektromechanischen Kopplung
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurde die Veränderung der spannungsgesteuerten Ca-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Reticulum in Skelettmuskelfasern durch Mutationen und verschiedene Modulatoren untersucht. Es wurden gentechnisch veränderte Mäuse verwendet, die es ermöglichten an enzymatisch isolierten, ausdifferenzierten Muskelzellen elektrophysiologische Experimente durchzuführen und fluorimetrische Messungen intrazellulärer Ca-Signale vorzunehmen. Ein Schwerpunkt lag auf der Untersuchung der Modulation der Ca-Freisetzung in einem Mausmodells für maligne Hyperthermie (MH). MH wird beim Menschen in der Regel durch volatile Anästhetika im Verlauf einer Vollnarkose ausgelöst und beruht auf dem durch exzessive Ca-Freisetzung über den Ryanodinrezeptor RyR1 verursachten Hypermetabolismus der Muskulatur. Das physiologische Steuersignal für die Ca-Freisetzung ist die elektrische Depolarisation der Muskelzellmembran. In einem Teil der Experimente studierten wir die Wechselwirkung zwischen dem Membranpotenzial und bekannten Triggerpharmaka für MH. Insbesondere konnten wir zeigen, dass das Anästhetikum Halothan, das in der MH-Diagnostik verwendet wird, die Potenzialabhängigkeit der Ca-Freisetzung zu negativeren Potenzialen verschiebt. Dies hat zur Folge, dass in Muskelzellen der Mutanten bereits beim Ruhemembranpotential die Potenzialschwelle für die Ca-Freisetzung überschritten wird. Der Befund bedeutet umgekehrt, dass die Empfindlichkeit für die MH-Triggerung durch das Anästhetikum stark vom Membranpotenzial abhängt. Wir glauben, dass dieses Ergebnis einen Teil der zu beobachtenden Variabilität in der MH-Suszeptibilität von genetisch prädisponierten Patienten zu erklären vermag. Weiterhin konnten wir unter Verwendung der R6/2-Maus zeigen, dass polyglutaminiertes Huntingtin die elektromechanische Kopplung ähnlich verändert wie eine MH-Mutation. Ein weiterer Teil des Projekts galt der Frage nach der Modulation der RyR1-Funktion durch die Ca-Ionen selbst. Die Ca-Freisetzung wird bei länger dauernder Depolarisation durch einen schnellen und einen langsamen Inaktivierungsprozess reduziert. Die schnelle Inaktivierung war der Fokus einer Kollaboration mit der Gruppe von M. Schneider (Baltimore) und lieferte Hinweise auf eine Wirkung von S100A1 unabhängig von der durch die RyR1- Mutation L3625D eliminierten Bindungsstelle. Die langsame Inaktivierung ist abhängig von der extrazellulären Ca-Konzentration und wird vermutlich bei klinisch relevanter Hypokalziämie verstärkt. Es wird vermutet, dass der Selektivitätsfilter des CaV1.1, der als L-Typ-Ca-Kanal und als Spannungssensor für die Ca-Freisetzung fungiert, für die Ca-Abhängigkeit der Inaktivierung verantwortlich ist. In einem Kollaborationsprojekt mit der Gruppe von M. Grabner (Innsbruck) untersuchten wir die Ca-Freisetzung in einer Maus, deren Ca-Permeation durch den CaV1.1. durch eine Aminosäuresubstitution (N617D) im Selektivitätsfilterbereich beseitigt ist. Diese Mutation zeigte bei hohem extrazellulären Ca keine offensichtliche Veränderung der Ca-Freisetzungskontrolle, bei niedrigem Ca-Spiegel war die Spannungsabhängigkeit der langsamen Inaktivierung der Ca-Freisetzung im Vergleich zum Wildtyp signifikant zu negativeren Potenzialen verschoben. Dies steht einerseits in Einklang mit der vermuteten Beteiligung des Selektivitätsfilters bei der spannungsabhängigen Inaktivierung, anderseits in Konflikt mit der bestehenden mechanistischen Vorstellung von diesem Prozess.
Publications
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