Ungewöhnliche RNA-Polymerasen: Reaktionsmechanismus und Substratspektrum von tRNA-Nukleotidyltransferasen

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr. Mario Mörl; Professorin Dr. Sonja J. Prohaska
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 219382169

CCA-addierende Enzyme (tRNA Nukleotidyltransferasen) sind hochspezifische RNA-Polymerasen mit außergewöhnlichen Eigenschaften. Sie synthetisieren mit höchster Genauigkeit die Sequenz C-C-A an das 3´-Ende von tRNAs und generieren damit die essentielle Position zur Aminoacylierung. Während sie hochselektiv CMP und AMP einbauen, akzeptieren sie sämtliche tRNAs in der Zelle, in Eukaryonten sogar cytoplasmatische wie mitochondriale tRNAs, deren Strukturen häufig abweichen. Als wichtige Erkennungselemente konnten wir neben dem Akzeptorstamm auch die Diskriminatorposition 73 identifizieren. Jetzt wollen wir die Erkennung dieser tRNA-Elemente durch CCA-addierende Enzyme aufklären und lernen, wie dies Effizienz und Genauigkeit der einzelnen Schritte der CCA-Addition beeinflusst. Dabei wollen wir unsere erfolgreichen ESR-Analysen ausbauen und die Bewegungen einzelner Domänen und Elemente in hoch interessanten Sonderformen dieser Enzyme charakterisieren, die zur spezifischen tRNA- bzw. Nukleotiderkennung notwendig sind. Mit Hilfe von spezifisch eingebauten nicht-natürlichen Aminosäuren, die sich mit benachbarten Positionen kovalent verlinken lassen, wollen wir intramolekulare Interaktionsregionen in den Enzymen identifizieren, die für ihre Funktionalität essentiell sind.Weiterhin haben wir in einer detaillierten Stammbaumanalyse in verschiedenen Pro- und Eukaryonten äußerst ungewöhnliche Kombinationen von verschiedenen tRNA Nukleotidyltransferasen gefunden. Diese Enzyme wollen wir nun charakterisieren, ihre spezifischen Funktionen sowie ihr Substratspektrum analysieren. Zusätzlich wollen wir die Evolution der verschiedenen tRNA Nukleotidyltransferasen durch bioinformatische anzestrale Sequenz-Rekonstruktionen aufklären. Dabei wollen wir gemeinsame Enzym-Vorfahren identifizieren und als rekombinante Proteine auf Substratspezifität, Polymerisationsreaktion, Temperaturoptimum und andere Parameter testen. Damit wollen wir klären, ob tRNA-Nukleotidyltransferasen mit partieller Aktivität (CC- bzw. A-addierende Enzyme), Poly(A)-Polymerasen oder andere Untergruppen der CCA-addierenden Enzyme den anzestralen Zustand in der Evolution darstellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen