Mehrkanal-Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Zur Klärung der neuronalen Efferenzen des Zebrafisch-Kleinhirns wurden transgene Tiere mit einer Purkinjezell (PC)-spezfischen Expression des trans-synaptischen Markers wheat germ agglutinin (WGA) etabliert. Zusammen mit retrodgraden Tracerstudien und 3D-LSM-Rekonstruktionen fluoreszierender Axone konnte gezeigt werden, dass die PC-Zellschicht in Kompartimente unterschiedlicher Konnektivität und Funktion unterteilt ist. In transgenen Tieren mit PC-spezifischer Expression eines genetisch kodierten Calcium-Indikators konnte mit Hilfe von Resonanzscanner-LSM-Aufnahmen gezeigt werden, dass bei unterschiedlichen stereotypen lokomotorischen Verhaltensmustern räumlich getrennte PC-Areale einen Anstieg der intrazellulären Ca2+ -Konzentration aufwiesen. Um diese Korrelation einer funktionalen Kompartimentierung der PC-Schicht zu untermauern, wurden stabil transgene Zebrafische mit PC-spezifischer Expression von licht-aktivierbaren Ionenkanälen (Channelrhodopsin/Archaerhodopsin) etabliert. Mit einer sukkessiv kleiner werdenden region of interest Anregung von PC-Arealen konnte allmählich die PC-Region identifiziert werden, welche für die Kontrolle der lokomotorischen Ausübung eines jeweiligen Verhaltens notwendig war. Hierbei zeigte sich, dass unterschiedliche Verhaltensmuster von unterschiedlichen PC-Arealen kontrolliert werden, wobei auch zwischen zugrunde liegenden ipsi- und kontrolateralen Verschaltungen unterschieden werden konnte. Diese Daten konnten nur aufgrund der hohen räumlichen Auflösung, der punktgenauen und räumlich definierbaren Anregung sowie der schnellen Scangeschwindigkeit mittels des konfokalen Laserscanningmikroskops erhoben werden. In analogen Analysen zu PC-Efferenzen mittels WGA und räumlich hochauflösenden Rekonstruktionen von retrograden Tracern in tiefen Gewebsschichten konnte die umstrittene Existenz eines Nukleus ruber in Zebrafisch manifestiert und seine Position im Tegmentum des Mittelhirns lokalisiert werden. Mit Hilfe hochauflösender 3D-Rekonstruktionen aus optischen LSM-Schnitten wurde in einer Gal4-Enhancer-trap-Linie das Expressionsmuster des Adhäsionsmoleküls JamB2 im Zebrafisch bestimmt sowie die Lage und Ausdehnung der extraokularen Muskeln charakterisiert. Mit zeitlich hochauflösenden LSM-Aufnahmen während einer induzierten optokinetischen Antwort von Zebrafischlarven konnten die Kontraktionsmuster dieser Muskeln in vivo dargestellt werden. Des weiteren konnten wir ein zelltypspezifisches induzierbares Zellablationssystem etablieren, welches auf der Induktion Caspase-vermittelter Apoptose basiert. Anschließend wurde ein PC-spezifisches stabil transgenes Ablationsmodell etabliert, mit dem innerhalb weniger Stunden nahezu die komplette PC-Population in die Apoptose getrieben werden kann. Durch Koexpression eines Fluoreszenzproteins mit der induzierbaren Caspase konnten wir mit Hilfe hochauflösender 3D-LSM-Rekonstruktionen das Ausmaß der Ablation quantifizieren sowie deren zeitlichen Verlauf charakterisieren. Schnittaufnahmen der adulten PC- Schicht zeigten dabei, dass das Ablationssystem keine Hintergrundaktivität hat und nur durch seine Induktion aktivierbar ist. Kolokalisationsstudien und 3D-Rekonstruktionen von LSM-Schnittaufnahmen in doppel transgenen Zebrafischlarven ermöglichten den Nachweis, dass das etablierte Ablationssystem weder in den PC-Afferenzen wie den Granulärzellen noch in der efferenten PC-Population den eurydendroiden Zellen einen apoptotischen Zelltod auslöst und somit in seiner Aktivität spezifisch auf den Caspase-exprimierenden Zelltyp begrenzt ist. In vivo Zeitrafferaufnahmen in doppel transgenen Zebrafischlarven nach erfolgter PC-Ablation konnten dabei das Einsetzen einer Entzüdungsreaktion dokumentieren und die Aktivierung von Mikroglia als eine der ersten zellulären Reaktionen auf die PC-Ablation dokumentieren. Mikroglia nehmen dabei an Zahl in Kleinhirn zu, wandern jedoch nicht aus anderen Hirnregionen in das Kleinhirn ein. Aktivierte Mikroglia beginnen, die zellulären Fragmente apoptotischer PCs zu phagozytieren, um so eine Neustrukturierung der PC-Schicht nach PC-Ablation einzuleiten.
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