Fluoreszenzbasierte Einzelmolekülstudien zur Dynamik und Mechanismen von Argonaute Proteinen und des RISC Komplexes

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dina Grohmann
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 217845747

In allen drei Domänen des Lebens übernehmen Argonaute Proteine Funktionen, die eine spezifische Regulation zellulärer Nukleinsäurelevel erlaubt. Humanes Argonaute 2 (hAGO2) und das archaeelle Argonaute aus Methanocaldococcus jannaschii (MjAGO) repräsentieren katalytisch aktive AGO-Varianten, die mithilfe einer kleinen RNA oder DNA (dem sogenannten guide) eine Zielnukleinsäure erkennen und endonukleolytisch spalten. Prokaryotische und eukaryotische AGO Proteine (pAGO, eAGO) weisen eine stark konservierte Struktur auf. Ihre biologische Funktion ist jedoch sehr unterschiedlich. eAGOs fungieren als Schlüsselenzyme im Prozess der sogenannten RNA Interferenz durch den schätzungsweise 60% unserer Gene reguliert werden. Fehler in diesem Prozess haben verheerende Konsequenzen und sind ursächlich für Diabetes, Krebs und Herzversagen verantwortlich. Neueste Studien zeigen, dass pAGOs in einen gänzlich anderen biologischen Prozess involviert sind – der Verteidigung einer Zelle gegen fremde genetische Elemente. pAGOs können in diesem Zusammenhang entweder in An- oder Abwesenheit eines guides agieren und spalten zumeist DNA statt RNA. Wie dies auf molekularer Ebene abläuft und reguliert wird, ist jedoch nur wenig verstanden.Ausgestattet mit einem breiten Spektrum an biochemischen, strukturellen und innovativen optischen Einzelmolekül-Methoden sind wir in der Lage, AGO Proteine hinsichtlich ihrer Struktur, Funktion und Dynamik zu charakterisieren. Unsere Studien sollen dazu dienen, ein weitreichendes Verständnis darüber zu erlangen, wie die stark konservierten AGO Proteine biologisch völlig verschiedenen Funktionen übernehmen können. Dafür ist es nötig, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Funktion von pAGOs und eAGOs steuern. Ziel ist es u.a., die Konformationsänderungen, die AGO Proteine im Laufe ihres Aktivitätszyklus durchlaufen, zu verstehen. Darüber hinaus möchten wir uns mit folgenden Schwerpunkten beschäftigen: Unsere funktionellen Studien und Kristallstrukturen von MjAGO deuten auf einen zweiten Nukleinsäurekanal hin, der selektiv nur von bestimmten Substraten eingenommen wird. Wir möchten untersuchen, ob und welche Substrate in diesem Kanal eingebettet werden und welche Konformationsänderungen im Protein damit einhergehen. Zusätzlich möchten wir verstehen, wie komplexe Substrate (bspw. Plasmid DNA) in pAGOs gebunden werden und welche Proteine die Aktivität von MjAGO kontrollieren. Viele regulierende Faktoren sind für hAGO2 bekannt, hier spielen neben Protein-Interaktionspartnern auch posttranslationale Modifaktionen eine wesentliche Rolle. Wie diese Regulatoren jedoch die Konformation von hAGO2 beeinflussen, ist nicht verstanden. Wir wollen daher die strukturelle Organisation und Dynamik von hAGO2 im Laufe seines Aktivitätszyklus über Einzelmolekül-FRET-Messungen bestimmen. Ein zusätzlicher Schwerpunkt wird darüber hinaus die Einzelmolekül-Analyse der Interaktion zwischen hAGO2 und der Vorläufernuklease Dicer darstellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen