Untersuchung der Photoschädigung bei der hoch aufgelösten Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Markus Sauer
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 216430964

Wir planen Methoden zum Studium und zur Minimierung der durch Bestrahlung induzierten Zellschädigung bei fluoreszenzmikroskopischen Studien mit speziellem Fokus auf neue hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsverfahren zu entwickeln. Hierfür sollen Methoden eingesetzt werden, die eine Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ermöglichen, die durch Bestrahlung fluoreszenzmarkierter Zellen entstehen. Der quantitative Nachweis von ROS, wie bspw. Singulettsauerstoff und Wasserstoffperoxid in lebenden Zellen ist von großem Interesse, da sie hauptsächlich für die Zellschädigung bei der Lebendzell- Fluoreszenzmikroskopie verantwortlich gemacht werden. ROS werden bei der Lebendzell- Fluoreszenzmikroskopie durch die Löschung bzw. Reduktion der Triplettzustände der Farbstoffe durch Sauerstoff und Thiole (in lebenden Zellen durch Glutathion) gebildet. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Zellschädigung wollen wir verschiedene intrazelluläre Kits zur Bestimmung von ROS basierend auf zellpermeablen nicht-fluoreszierenden Molekülen wie Dichlorodihydrofluorescein und Dichlororhodamin, die in Gegenwart von ROS schnell zu fluoreszierenden Molekülen oxidiert werden, vergleichend anwenden. Alternativ wollen wir genetisch kodierte, hoch spezifische fluoreszierende Proteine (bspw. das zirkular permutierte gelb fluoreszierende Protein HyPer) für den Organellspezifischen Nachweis von Wasserstoffperoxid in lebenden fluoreszenzmarkierten Zellen nach Bestrahlung einsetzen. Hierzu wollen wir verschiedene Proteine im Zellkern, im Cytoplasma und in den Mitochondrien mit verschiedenen organischen Farbstoffen mittels chemischen Tags und photoaktivierbaren fluoreszierenden Proteinen markieren. Durch die Variation verschiedener Anregungsgeometrien wie Weitfeld und Lightsheet sowie experimenteller Bedingungen wie Farbstoffkonzentration, Anregungsleistung und Bestrahlungsdauer, Einfluss von Erholungsphasen, Zusatz von Reduktionsmitteln wie Ascorbinsäure und Trolox, sowie die Modifizierung der Farbstoffe soll das Ausmaß und der Mechanismus der Zellschädigung durch Einzelmoleküllokalisation basierendes Super-Resolution Imaging aufgeklärt und schließlich herausgefunden werden, wie die Zellschädigung bei hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie-verfahren minimiert und damit Langzeitmessungen ermöglicht werden können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen