Structure, function and signalling in Cph1 and related phytochromes
Final Report Abstract
Phytochrome sind in der Natur weit verbreitete Photorezeptor-Proteine, universell bei Pflanzen und häufig bei Mikroorganismen wie Cyanobakterien und nicht-photosynthetischen Bakterien. Phytochrome absorbieren Licht mit Hilfe von Chlorophyll-verwandten Bilin-Kofaktoren. Charakteristisch für Phytochrome ist, dass sie durch Aufnahme von Rot- bzw Dunkelroten Licht zwischen zwei Zuständen, Pr und Pfr, verwandelt werden, wobei der Organismus auf die Menge von Pr bzw. Pfr reagiert. Meine AG hat maßgeblich zur Erforschung der Phytochrome beigetragen, insbesondere mit Studien zur Signaltransduktion in Niederen Pflanzen und der Struktur/Funktionsbeziehungen des cyanobakteriellen Phytochroms Cph1. Das Projekt setzte die Kooperation mit der AG Essen (Uni Marburg) fort, allerdings nach einer Unterbrechung der Förderung. Unser Ziel war es, die Funktionsweise des Cph1-Moleküls weiter zu untersuchen sowie die gewonnenen Erfahrungen auf pflanzliche Phytochrome zu übertragen. Obwohl diese Phytochrom-Arten besonders nah verwandt sind, ist die Arbeit mit pflanzlichen Phytochromen technisch ungleich schwieriger. Bei Cph1 gelang es uns, die Funktionen spezifischer Domänen, sogar einzelner Atome zu identifizieren. Besonders interessant war die Entdeckung der Rolle des Phenolsauerstoff-Atoms von Tyrosin-263 in der Nähe des Kofaktors: diese Aminosäure hilft dramatisch bei der erfolgreichen Aktivierung des Photorezeptors. Mit Hilfe der Fluorezenzspectroskopie sowie die 3D Röntgen-Kristallstruktur der Y263F-Mutante konnten wir die Rolle des Sauerstoffs entziffern. Ein weiterer Fokus war die Wirkung des Austauschs von Tyrosin-176 (ebenfalls in der Nähe des Kofaktors) mit Histidin: mit dieser Änderung wird Pfr nicht mehr gebildet, sondern eine starke Fluoreszenz hervorgerufen – jedoch in Pflanzen paradoxerweise wird die physiologische Wirkung von Pfr (selbst im Dunkeln!) hervorgerufen. Bei unserer Arbeit setzen wir stark auf kristallographische Methoden, ins Besondere die Röntgenkristallographie. Röntgenstrahlung ist allerdings besonders schädlich für Phytochrom- Moleküle und kann, ferner, Protonen (Wasserstoff-Ionen) nicht detektieren. Protonierungsdynamik spielt jedoch eine zentrale Rolle in der molekularen Funktion der Phytochrome. Wir sind daher glücklich, erstmals weltweit die Neutronenkristallographie in der Phytochromforschung erfolgreich angewendet zu haben: diese Methode ermöglicht Protonen zu detektieren und vermeidet nennenswerten molekularen Schaden. Diese Arbeit wird seit Januar 2017 als Teilprojekt B8 im Berliner SFB1078 fortgesetzt. Während spektroskopische Methoden zwar keine 3D-Bilder liefern, geben sie sehr wichtige Hinweise zu den dynamischen Prozessen der Pr↔Pfr Konversion und ergänzen die direkten Strukturstudien. Hierbei waren Fluoreszenz-, CD-, Resonanz-Raman sowie ultraschnelle Absorptionsspektroskopische Methoden u.a. in Zusammenarbeit mit entsprechenden FachkollegInnen von besonderer Bedeutung im Projekt. Phytochrome kommen in verschwindend geringen Mengen in Pflanzenzellen vor und sind dazu sehr schwierig zu extrahieren. Es ist daher unerlässlich, die Gene stattdessen in Fremdorganismen wie E. coli zu exprimieren – allerdings müssen dort die notwendigen Kofaktoren zur Verfügung gestellt werden. Es ist uns gelungen, entsprechend auf pflanzliche Phytochrome zu übertragen. Wir konnten Milligramm-Mengen photochemisch-funktionsfähiges Phytochrom-B von Sorghum bicolor in E. coli produzieren und in hoher Konzentration bei fast 100% Reinheit aufarbeiten. Daraus haben wir bereits Kristalle unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, und erwarten 3D-Strukturdaten bei atomarer Auflösung bekommen zu können. Auch dies ist Aufgabe des SFB1078/B8 Teilprojekts. Mit diesen Studien wollen wir vordergründig die molekulare/n Funktionsweise/n des Phytochroms besser verstehen. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, neuartige Werkzeuge für die Zellbiologie bis hin zu agrarwirtschaftlichen Verbesserung anhand dieses Wissens zu entwickeln.
Publications
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