Molekulare Analyse und Relevanz der Interaktion von Komplementregulator Faktor H und FHL-1 mit CRASP-Proteinen von Borrelia burgdorferi
Final Report Abstract
Im Rahmen des Projektes: „Molekulare Analyse und Relevanz der Interaktion von Komplementregulator Faktor H und FHL-1 mit CRASP-Proteinen von Borrelia burgdorferi“ wurden verschiedene Aspekte zur Interaktion von Borrelien mit Komponenten des humanen Serums untersucht. Die Frage nach den zugrundeliegenden Mechanismen der natürlichen Serumresistenz von B. burgdorferi und der detaillierten Charakterisierung der verantwortlichen Determinanten (CRASP-Proteine) bildete dabei den Schwerpunkt unserer Untersuchungen. Unsere Studien belegen, dass ausschließlich CRASP-1 oder CRASP-2, nicht jedoch CRASP-3, CRASP-4 und CRASP-5 für die Serumresistenz von B. burgdorferi verantwortlich zeichnen. Für CRASP-1 und CRASP-2 konnten die mit Faktor H-interagierenden Domänen sowie einzelne, an der Bindung beteiligten Aminosäuren, identifiziert werden. Insbesondere die C-terminale Region bei CRASP-1 ist für die Dimerisierung des Proteins von entscheidender Bedeutung während innerhalb des C-Terminus von CRASP-2 die für die Interaktion mit Faktor H und FHL-1 essentiellen Aminosäuren lokalisiert sind. Für diese Untersuchungen wurden erstmals Borrelientransformanten generiert, die mutierte CRASP-2 Proteine produzierten. Weiterführende Versuche bewiesen, dass CRASP-1 von B. burgdorferi als auch die CRASP-1 orthologen Proteine von B. afzelii und B. spielmanii inhibitorisch auf die Aktivierung des terminalen Komplementweges wirken und dabei die Assemblierung des terminalen Komplementkomplexes blockieren. Mit verschiedenen N- und C-terminalen CRASP-1 Mutanten ließ sich die Komplement-regulatorische Domäne auf den N-Terminus eingrenzen. Diese Proteine besitzen demnach zwei separate Domänen, um mit unterschiedlichen Komplementkomponenten zu interagieren. Abweichend zur anfänglichen Hypothese musste festgestellt werden, dass weder CRASP-3 noch CRASP-4 oder CRASP-5 entscheidend an der Serumresistenz von B. burgdorferi beteiligt sind. Obwohl die gereinigten Proteine in der Lage waren, Faktor H zu binden, wiesen die in vivo produzierten Proteine einen völlig anderen Bindungscharakter auf. Anstatt der erwarteten Faktor H-Bindung, konnte bei diesen Borrelientransformanten die Bindung von FHR-1, FHR-2 und FHR-5 nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu den CRASP-1 und CRASP-2 positiven Borrelien wiesen die CRASP-3, CRASP-4 und CRASP-5 positiven Transformanten in Gegenwart von aktivem Komplement einen serumempfindlichen Phänotyp auf, der mit der fehlenden Bindung von Faktor H korreliert. Wie anfangs postuliert, sind alle CRASP-Proteine durch ein multifunktionelles Bindungsverhalten charakterisiert. Gemeinsam für alle fünf CRASP-Proteine ist die Bindung von Plasmin(ogen) und für CRASP-1 und CRASP-2 die Bindung an Fibronectin und Laminin. Des Weiteren konnte eine Bindung von CRASP-1 an Kollagen I, III und IV nachgewiesen werden. Dieses spezielle Bindungsverhalten an extrazelluläre Matrixkomponenten impliziert, dass CRASP-1 und CRASP-2 als potentielle Adhäsionsmoleküle fungieren könnten. Untersuchungen mit humanen Keratinozyten liessen vermuten, dass CRASP-Proteine tatsächlich die Adhäsion von Borrelien an humane Zellen beeinflussen. Wir konnten feststellen, dass CRASP-4 positive Zellen signifikant besser an humane Keratinozyten adhärierten als CRASP-1-, CRASP-2-, CRASP-3-, oder CRASP-5-produzierende Borrelientransformanten. Untersuchungen zur Temperatur-induzierbaren Expression von CRASP-2 offenbarten, dass dieses Gen ausschließlich im murinen Wirt exprimiert wird, nicht jedoch in der Zecke. Somit sind die Borrelien während der Dissemination gegenüber der Komplement-vermittelten Bakteriolyse geschützt. Des Weiteren konnten unsere anwendungsorientierten Studien CRASP-2 als später serologischer Marker für die Diagnostik der Borreliose identifizieren. Damit leisten die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis des Immunescape von B. burgdorferi, B. afzelii und B. spielmanii, den Erregern der Borreliose, sowie der maßgeblich an der Serumresistenz beteiligten Determinanten dieser drei Genospezies.
Publications
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