Functional analysis of the LipA phosphatase, a new virulence factor of Listeria monocytogene
Final Report Abstract
Das Ziel dieses Projektes war die Funktion der Phosphatase LipA des intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes zu erforschen. Unsere vorangehenden Experimente hatten gezeigt, dass LipA zur Virulenz von L. monocytogenes beiträgt. Infektion von Mäusen mit LipA-defizienten Bakterien (ΔlipA) führten zu einer niedrigeren Bakterienlast in Leber und Milz im Vergleich zur Infektion mit einem Wildtyp-Bakterienstamm. Die Letalität der Infektion war also reduziert mit ΔlipA L. monocytogenes. Unsere biochemische Studie der Phosphatase zeigte, dass LipA in vitro nicht nur Phospho-Tyrosin sondern auf Phosphoinositolphosphat (PIP) dephosphorylieren kann. Jedoch konnten wir anhand unserer ersten Experimente keine Funktion von LipA im intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes identifizieren. Deshalb formulierte ich die Hypothese, dass LipA vermutlich in einen antimikrobiellen Signalweg von myeloiden Zellen eingreift und so zum Ermöglichen des intrazellulären Überlebens von L. monocytogenes beitragen könnte. Das zentrale Ziel dieses Projektes war es, zelluläre und molekulare Zielstrukturen dieser Phosphatase zu finden und näher zu beschreiben. Jedoch konnten wir im Laufe unserer Untersuchung unsere Ausgangshypothese, dass LipA die Aktivität der NADPH-Oxidase von phagozytierenden Zellen, nicht bestätigen. LipA inhibierte weder die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROI) durch neutrophile Granulozyten oder Makrophagen noch modulierte die Phosphatase deren bakterizide Aktivität. Dies war als mögliches Ergebnis in unserem originalen Projekt vorausgesagt worden. Aus diesem Grund plante ich außer dem Einfluss von LipA auf Phagoyzten auch die mögliche Interaktion von LipA mit weiteren Zellen des angeborenen Immunsystems zu untersuchen, basierend auf den bereits vorhandenen Daten bzgl. des Genexpressionsprofils. Unerwarteterweise konnte ich die Induktion der LipA-Expression durch humanes Blut nicht reproduzieren, trotz einer großen Anzahl unabhängiger Experimente (n=10). Nichtsdestotrotz bleibt die Bestimmung der Kinetik der LipA-Expression und der Bedingungen, die die Expression von LipA beeinflussen von großer Bedeutung. Unsere aktuellen Experimente zielen darauf ab, diesen bedeutenden Schritt im Verstehen des Wirkmechanismus von LipA während des Infektionsverlaufes zu adressieren. Gleichzeitig zu den Expressionsanalysen wurden Experimente durchgeführt, um nach den molekularen Zielstrukturen von LipA zu suchen und zwischen Phosphoinositol- und Phospho-Tyrosin-Proteinen als möglichen Interaktionspartnern zu unterscheiden. Unsere Suche nach einem Substrat hat bisher noch kein positives Resultat ergeben, hauptsächlich aufgrund der Toxizität des Proteins bei ektopischer Expression in Wirtszellen. Um diese Erscheinung zu umgehen, wurde eine induzierbare Zelllinie entwickelt, die derzeit untersucht wird. Schlussendlich wird das LipA-Projekt trotz einiger Umstrukturierungen momentan weitergeführt. Derzeit werden noch Untersuchungen bezüglich des molekularen Wirkmechanismus der Phosphatase LipA durchgeführt. Neue Methoden sind nur verfügbar das molekulare Target zu untersuchen und unsere Analyse des Expressionsprofiles von LipA während des Infektionsverlaufes werden uns eindeutig helfen, die Funktion dieser von L. monocytogenes sezernierten Phosphatase besser zu verstehen.
