Hochgeschwindigkeits-Cell-Sorter
Final Report Abstract
Der Cell-Sorter steht im Physiologischen Institut in der Abteilung für Zelluläre Neurophysiologie und wird als dezentrale Facility betrieben. Somit steht das Gerät allen interessierten Forschungsgruppen der Universität zur Verfügung. Insgesamt haben über 20 verschiedene Gruppen auf das Gerät zugegriffen, wovon 7 Gruppen regelmäßige Nutzer (monatlich oder öfter) sind. Die Nutzung lässt sich in vier verschiedene Bereiche aufteilen. 1. Aufreinigung von Blutzellen in verschiedene Subpopulationen. In unserer Arbeitsgruppe und anderen Arbeitsgruppen wird mit zytotoxischen T Lymphozyten gearbeitet. Diese Zellen werden entweder aus Leukozytenpräparationen des Menschen (PBMCs – peripheral blood mononuclear cells) oder Milzpräparaten der Maus nach Markierung (CD8) aussortiert. Vergleichbare Aufreinigungen werden außerdem von natürlichen Killerzellen, B Zellen und verschiedenen Subpopulationen von T Zellen regelmäßig hergestellt. 2. Anreicherungen von transient überexprimierenden Zellen. Wir und andere Arbeitsgruppen nutzen den Zell Sorter außerdem, um bei niedrigen Transfektionsraten (z.B. bei Doppeltransfektionen) erfolgreich transfizierte Zellen anzureichern. Als Marker werden dafür fluoreszierende Proteine, die entweder als Fusionsproteine mit dem Zielprotein vorliegen oder über ein IRES-Konstrukt unabhängig exprimiert werden, genutzt. 3. Aufreinigung zellulärer Bestandteile. Unserer Arbeitsgruppe steht eine Mauslinie zur Verfügung, die ein mRFP-Synaptobrevin2-Fusionsprotein anstelle des endogenen Synaptobrevin2 exprimiert. Wir nutzen dieses Fusionsprotein um intrazelluläre Synaptobrevin2 exprimierende Vesikel aus Lysaten zytotoxischer T Lymphozyten aufzureinigen. Ziel ist es, das Proteom dieser Vesikel massenspektrometrisch zu charakterisieren. 4. Aufreinigung neuronaler Zellen aus Mauslinien. In zwei andauernden Kooperationen werden aus neuronalen Primärkulturen von Maushirnen diejenigen Neurone aussortiert, die bestimmte Zielproteine exprimieren. Dazu wurden Mauslinien hergestellt, die die Zielproteine als GFP-Fusionsproteine unter der Kontrolle endogener Promotoren exprimieren. Die Erkennung und Sortierung im Cell-Sorter erfolgt über das GFP.
Publications
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