Analyse der CRISPR-Cas Systeme in Cyanobakterien

• Antragsteller: Professor Dr. Wolfgang R. Hess
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 192503913

In der hier beantragen Förderperiode möchten wir unsere Arbeiten zur Charakterisierung der drei CRISPR-Cas Systeme (eines wurde als Subtyp I-D, eines als atypisches Subtyp III und eines als Subtyp III-B klassifiziert) in dem Cyanobakterium Synechocystis 6803 fortsetzen. Nach Aufreinigung über FLAG-tags und Immunopräzipitation werden wir die exakte Zusammensetzung der CRISPR Ribonukleoproteinkomplexe bestimmen. Wir werden Mutantenphänotypen charakterisieren und Komplementationsanalysen ausführen. Wir werden synthetische CRISPR Loci auf dem konjugativen pVZ Vektor konstruieren und diese verwenden, um die Details der Spacererkennung und Sequenzrepeatcharakteristika zu charakterisieren. Wir beabsichtigen, tiefer in die Strukturanalyse der bakteriellen Subtyp I-D Proteine einzudringen, d.h. den CRISPR-Subtyp über den bisher am wenigsten Information verfügbar ist. Die Transkription der CRISPR-Cas Gene und Kassetten wird in Synechocystis 6803 durch kürzlich von uns identifizierte regulatorischeProteine kontrolliert. Wir planen, die Bedingungen und Signaltransduktionsketten, die zu dieser Regulation gehören, näher zu charakterisieren und somit deren physiologische Funktion näher zu charakterisieren. Ungeachtet einiger Bemühungen, gibt es noch keinen bekannten Bakteriophagen für Synechocystis 6803. Im von uns untersuchten Stamm 6714, einem engen Verwandten von Synechocystis 6803, haben wir eine 22.5 kb Prophageninsertion identifiziert, die möglicherweise induziert werden kann. Zusätzlich möchten wir nach nativen Bakteriophagen suchen, die in der Lage sind, einen oder beide dieser Synechocystis Stämme zu infizieren und möchten unsere Analysen auf ausgewählte Aspekte des CRISPR-Cas Systems in Synechocystis 6714 ausdehnen (eines ist ein atypischer I-A oder I-B Subtyp und die anderen zwei sind verschiedene III-B Subtypen). Im letzten Abschnitt unseres Projektes möchten wir Proben aus semiindustriellen Pilotanalagen analysieren, in denen die großangelegte Kultivierung von Cyanobakterien zur Herstellung sogenannter Biokraftstoffe der 3. Generation stattfindet, mit Kultivierungszeiträumen von bis zu mehreren Monaten. Damit besitzen diese Systeme einen extremen Skalierungsfaktor gegenüber traditionellen biotechnologischen Anlagen und das Risiko von Kontaminationen und Infektionen durch Bakteriophagen ist dementsprechend hoch. Infolgedessen bestehen substanzielle Herausforderungen für die endogenen CRISPR Systeme in den verwendeten Produktionsstämmen. Hier möchten wir die Frage beantworten, wie evolvieren die CRISPR-basiertem Immunsysteme solcher Produktionsstämme? Dieser Projektteil wird Ergebnisse zur CRISPR Mikroevolution generieren, besitzt aber auch Aspekte von potentiellem angewandtem Interesse.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1680: Unravelling the prokaryotic immune system