Zellhüllen für Multienzym-Synthesen: Ansätze zur Erhöhung der katalytischen Aktivität

• Antragsteller: Professor Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 206669210

Mikroorganismen mit überexprimierten Syntheseenzymen finden häufig Anwendung in Biotransformationen. Attraktiv sind diese Ganzzellansätze, da keine kostenintensive Isolierung der beteiligten Enzyme notwendig ist. Nachteile sind hingegen Nebenreaktionen durch zelleigene Enzyme und die Stofftransportlimitierung durch die Zellmembran. Diese Nachteile werden durch die Verwendung isolierter Enzyme umgangen, jedoch müssen diese meist immobilisiert werden, um einen ökonomischen Einsatz zu gewährleisten. Durch die Entwicklung eines neuen Ein-Schritt-Verfahrens zur Expression und Immobilisierung von Enzymen auf Basis bakterieller Zellhüllen ist es gelungen, wesentliche Vorteile der Verwendung ganzer Zellen und isolierter Enzyme zu verbinden. Hierbei werden die Syntheseenzyme durch genetische Fusion mit Membranankern versehen und so nach der Expression in der Cytoplasmamembran von E. coli-Zellen immobilisiert. Anschließend wird ein Phagenprotein exprimiert, was zur Bildung einer Lysepore führt. Aufgrund der osmotischen Druckdifferenz zwischen dem Zellinneren und dem umgebenden Medium wird der cytoplasmatische Inhalt durch die gebildete Pore ausgetrieben, während verankerte Proteine in den leeren Zellhüllen enthalten bleiben. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass Zellhüllen mit verankerter beta-Galactosidase den korrespondierenden ganzen Zellen mit überexprimierten Enzymen deutlich überlegen waren, da die Lysepore zur einer Reduktion der Stofftransportlimitierung für das Substrat und dadurch zu einer dreifach höheren Enzymaktivität führte. Bislang wurde nur die Cytoplasmamembran der Zellhüllen zur Enzymimmobilisierung genutzt. Um die Aktivität der biokatalytischen Präparationen zu steigern, sollen zwei verschiedene Ansätze verfolgt werden: Zum einen sollen zusätzlich Enzyme auf der Zelloberfläche mittels Surface Display präsentiert werden. Zum anderen soll auch der Innenraum der Zellhüllen genutzt werden. Hierbei müssen Strukturen verwendet werden, die bei der Lyse nicht aus den Zellen freigesetzt werden. Kandidaten hierfür sind intrazelluläre Membranen, bakterielle Oberflächenschichtproteine und bakterielle Cytoskelette. Als Reaktionssystem soll ein Zweienzymsystem aus einer Enreduktase aus Cyanobakterien und einem Cofaktorregenerierungsenzym (Formiatdehydrogenase oder Glucosedehydrogenase) betrachtet werden, das für die Reduktion von (R)-Carvon zu (2R,5R)-Dihydrocarvon eingesetzt wird. Die verschiedenen Zellhüllen mit immobilisierten Enzymen sollen reaktionstechnisch im Hinblick auf die asymmetrische Synthese charakterisiert werden. Die Zellhüllen mit maximalen und möglichst ausgeglichenen Enzymaktivitäten sollen mit ganzen Zellen und isolierten Enzymen in Ein- und Zweiphasensystemen biokatalytisch verglichen werden. Abschließend sollen Untersuchungen zur Skalierbarkeit der Herstellung der Zellhüllen und ihrer Aufarbeitung über Membranverfahren sowie der asymmetrischen Synthese erfolgen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Professorin Dr. Kathrin Castiglione