Funktionelle Charakterisierung der Interaktion zwischen dem Multidrug Resistenz 1 Protein und Caveolin 1 und deren Bedeutung für die Radioprotektion von Normalgewebszellen
Final Report Abstract
Für die Untersuchungen zur Radioprotektion und Lokalisation von CAV1 und MDR1 wurde gemäß TP1 ein Zellmodell basierend auf der lymphoblastoiden Zelllinie TK6 etabliert, in dem CAV1 und MDR1 gleichzeitig exprimiert werden. Die Funktionalität von MDR1 konnte im Rhodamin123-Assay bestätigt werden. Mittels dem Vitalfarbstoff AlamarBlue und dem MTT-Assay wurde das Proliferationsverhalten, mittels Koloniebildungstest die Überlebensfraktion nach Bestrahlung bestimmt. Die erhobenen Daten zu Überleben und Proliferation nach Bestrahlung in diesem Zellmodell (TP2) konnten jedoch keinen Aufschluss über eine mögliche erhöhte Radioprotektion durch die gleichzeitige Expression von CAV1 und MDR1 im Vergleich zur Einzelexpression geben. Um in TP3 der Rolle der für die CAV1-Funktion bedeutsamen Phosphorylierungsstelle Tyr14 nachzugehen, wurde erfolgreich die Zelllinie TK6-CAV1^Y14F etabliert. Hier konnten wir nachweisen, dass der Einsatz von 10 mM H2O2 die Phosphorylierung von CAV1 und die Phosphorylierung der Stresskinasen SFK, p38 und JNK induzierte. Auch durch ionisierende Bestrahlung wurden alle untersuchten Proteine phosphoryliert, jedoch war diese niedriger als nach H2O2 Behandlung. Die Phosphorylierung von CAV1 war 15 min nach Bestrahlung am höchsten und sank in den folgenden Stunden etwas ab. SFK war zu den frühen Zeitpunkten ebenfalls deutlich phosphoryliert und blieb konstant. p38 hingegen war zu den frühen Zeitpunkten nur gering phosphoryliert und stieg im Zeitverlauf kontinuierlich. Die Phosphorylierung von JNK zeigte eine andere Kinetik von initialem Absinken und anschließendem Anstieg auf Kontrollniveau. In unserem Zellsystem war kein Unterschied zwischen 2 Gy und 4 Gy im Phosphorylierungsgrad zu verzeichnen. Zur Untersuchung der Rolle der Kinasen bei der Phosphorylierung von CAV1 wurde die Funktionalität der Kinaseinhibitoren zuerst im H2O2-System getestet, um einen geeigneten Zeitraum (1 h) und eine geeignete Konzentration (10 µM) für die Inhibitoren zu ermitteln. Nach H2O2-Behandlung unter diesen Konditionen verursachten die Inhibitoren von p38 und JNK eine Reduktion der CAV1 Phosphorylierung um 55 % und der SFK-Inhibitor um 70 %. Durch die Inhibition von p38 und JNK fanden wir den konsistenten Trend der um etwa 30 % verringerten CAV1 Phosphorylierung nach ionisierender Bestrahlung, während die Inhibition von SFK keinen Effekt hatte, wobei keine statistische Signifikanz erreicht wurde. Bei den Untersuchungen der Apoptosewege nach Bestrahlung (TP4) fanden wir, dass Caspase3/7 und der FAS-Signalweg aktiviert werden. Außerdem zeigten wir, dass es 16 h – 48 h nach Bestrahlung zur Caspase 8 Spaltung kam, während BID und BAX wenig erhöht waren. Vorläufige Daten lassen eine verringerte Apoptoseinduktion durch die Überexpression von CAV1 oder MDR1 vermuten und sollen bis zum Promotionsende vervollständigt und um die gleichzeitige Überexpression von CAV1 und MDR1 erweitert werden. Weiterhin wird mittels Proliferations- und Koloniebildungsassay der Bedeutung der Phosphorylierung von CAV1 Tyr14 bezüglich Zellüberleben nach Bestrahlung nachgegangen, und es soll untersucht werden, ob CAV1 Tyr14 einen Einfluss auf die Funktionalität von MDR1 hat. Die umfangreichen Etablierungen von Immunfluorszenzfärbung und Konfokalmikroskopie (TP5) sollen abschließend verwendet werden, um Lokalisationsstudien zwischen CAV1 und MDR1 zu betreiben und die Möglichkeit der Interaktionen zu untersuchen.
Publications
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(2015). Bestrahlung induziert die Phosphorylierung von Tyr14 in Caveolin-1. Proceedings des 24. Symposiums Experimentelle Strahlentherapie und Klinische Strahlenbiologie, Band 24, pp. 64-66
Bradl J, Maier P, Wenz F, Herskind, C
