Molekulare und kristallographische Analyse einer multifunktionellen Lipoxygenase aus Physcomitrella patens
Final Report Abstract
In dem vorliegenden Projekt wurde zunächst eine neuartige bifunktionelle LOX aus dem Blasenmützenmoos P. patens näher untersucht. Dieses Enzym ist bisher einzigartig, da es neben der klassischen Dioxygenase-Reaktion zusätzlich eine Hydroperoxid-Lyase-Aktivität besitzt, die das intermediär gebildete Hydroperoxid in flüchtige Alkohole/Alkanole und ω-Oxo-Fettsäuren spaltet. Zunächst wurde ein heterologes E. coli-Expressionssystem etabliert, mit dem sich PpLOX in einem prinzipiell ausreichenden Maß herstellen ließ. Es zeigte sich allerdings, dass das Enzym unter den angewandten Versuchsbedingungen extrem instabil war und weder über eine angehängte Hexahistidinsequenz mittels Ni-NTA-Technologie noch über ein klassisches Protokoll in stabiler Form gereinigt werden konnte. Aus diesem Grund wurden in einem parallelen Ansatz verkürzte LOX- Konstrukte generiert, die zu einer erhöhten Stabilität führen sollten. Als Ausgangspunkt für diese Untersuchungen dienten zwei PpLOX-Konstrukte, für die eine 12-Arachidonat-LOX-Aktivität berichtet wurde: PpLOX1 und PpLOX2. Während keines der verkürzten PpLOX1-Konstrukte eine enzymatische Aktivität besaß, konnte ein verkürztes PpLOX2-Konstrukt generiert werden, das ebenfalls 12- Arachidonat-LOX-Aktivität besaß. Dieses Enzym konnte zudem zwar leicht über eine angehängte Hexahistidinsequenz mittels Ni-NTA-Technologie gereinigt werden, doch erwies sich auch dieses Konstrukt sich als instabil und verlor die gesamte katalytische Aktivität nach ca. 20 h. Die stark ausgeprägte Instabilität beider PpLOX-Isoformen beeinträchtigten das Forschungsvorhaben immens und führten dazu, dass die meisten Versuche nur mit angereichertem Enzymextrakt durchgeführt wurden. Kinetische Analysen zeigten, dass PpLOX1 eine Substratspezifität für C20-Fettsäuren besitzt, wobei Arachidonsäure das bevorzugte Substrat ist. Weiterhin zeigten Untersuchungen zur Substratorientierung im aktiven Zentrum der PpLOX1, dass die Fettsäure mit dem Methylende voran in die Substratbindungstasche gelangt. Zudem konnte mit Hilfe bioinformatischer Software ein homologes Strukturmodell der PpLOX1 erstellt werden, das auf der bekannten Struktur anderer LOXen basierte. Auf dieser Grundlage, konnten konservierte Aminosäuren identifiziert und mittels gerichteter Punktmutagenese ausgetauscht werden. Es gelang bisher weder Determinanten für die Substratbindung im aktiven Zentrum noch für die ungewöhnliche Hydroperoxid-Lyase-Aktivität zu identifizieren. Im Zuge einer Kooperation mit Michael Kolomiets konnte eine weitere LOX identifiziert und analysiert werden, die ebenfalls im Chloroplasten lokalisiert ist (ZmLOX6). Die biochemischen Untersuchungen zeigten, dass es sich bei diesem Enzym um ebenfalls um eine LOX handelt, die eine HPL-Aktivität besitzt. Jedoch war auch dieses Enzym in seiner gereinigten Form extrem instabil und konnte daher nich weiter charakterisiert werden. Des Weiteren wurden zwei AOC-Isoformen aus P. patens kloniert und sowohl biochemisch als auch strukturell untersucht. Es konnten für beide Enzyme mehrere hochauflösende Kristallstrukturen erstellt werden, die unter anderem als Ausgangspunkt für Mutagenesestudien dienten. So konnte ein Aminosäurerest bestätigt werden, der für die katalytische Aktivität beider Enzyme scheinbar essentiell ist. So zeigte sich, dass dieser Glutamatrest im aktiven Zentrum der AOC eine bedeutende Rolle für die Zyklisierungsreaktion besitzt. Außerdem konnte ein Argininrest identifiziert werden, von dem angenommen werden kann, dass er an der Substratbindung beteiligt ist. Biochemische Analysen zeigten weiterhin, dass nur PpAOC2 die Allenoxide von 12-Hydroperoxiden der Arachidonsäure zu Cylcopentenonen umsetzen kann, nicht aber PpAOC1.
Publications
- (2008). A novel plastidial lipoxygenase of maize (Zea mays) ZmLOX6 encodes for a fatty acid hydroperoxide lyase and is uniquely regulated by phytohormones and pathogen infection. Planta, 227: 491-503
Gao, X., Stumpe, M., Feussner, I. & Kolomiets, M.
- (2009). Physcomitrella patens has lipoxygenases for both eicosanoid and octadecanoid pathways. Phytochemistry, 70: 40-52
Anterola, A., Göbel, C., Hornung, E., Sellhorn, G., Feussner, I. & Grimes, H.
- (2010). The moss Physcomitrella patens contains cyclopentenones but no jasmonates: mutations in allene oxide cyclase lead to reduced fertility and altered sporophyte morphology. New Phytol
Stumpe, M., Gobel, C., Faltin, B., Beike, A.K., Hause, B., Himmelsbach, K., Bode, J., Kramell, R., Wasternack, C., Frank, W., Reski, R. & Feussner, I.
(See online at https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2010.03406.x)
