Charakterisierung und Modifikation der Substratspezifität clostridieller Neurotoxine
Final Report Abstract
Botulinumneurotoxine (BoNT) verhindern die Acetylcholin-Freisetzung an der neuromuskulären Endplatte, indem sie SNAREs, Kernkomponenten des Vesikelfusionsapparates, proteolysieren. Dadurch wird die Muskulatur gelähmt. Serotyp A der BoNT ist seit Jahren zugelassenes Medikament für die Behandlung von auf Überaktivität von Muskeln beruhenden Erkrankungen. Bei Erkrankungen, die auf übermäßiger Sekretion nicht neuronaler Zellen beruhen, können BoNT nicht angewendet werden, vor allem weil die an diesen Membranfusionsprozessen beteiligten SNAREs keine Substrate der BoNT sind. Ziel des Projektes war es deshalb zu analysieren, ob die Substratspezifität der katalytischen Untereinheit durch Mutation so verändert werden kann, dass SNARE Isoformen wie hSNAP-23 (humanes SNAP-23) und TI-VAMP effizient gespalten werden können. Zunächst wurden diejenigen Aminosäuren des hSNAP-23 durch sukzessives Austauschen der Reste, die im nativen Substrat SNAP-25 nicht konserviert sind, sowie durch reziproke Austausche in SNAP-25 identifiziert, die die Spaltbarkeit des Moleküls reduzieren. Resultat der Studie war, dass 10 der 23 abweichenden Aminosäuren des interagierenden Bereich die 100000-fach schlechtere Spaltbarkeit von hSNAP-23 vollständig erklären. Durch bereits existierende SNAP-25-BoNT/A Kokristall-Strukturdaten und in Kollaboration in diesem Projekt durchgeführte „Molecular Dynamics Simulation“-Studien wurden als nächstes die Bindungstaschen der 10 kritischen Substratpositionen identifiziert und durch Mutationsanalyse an der katalytischen Domäne (LC) von BoNT/A verifiziert. Zur Anpassung von LCA an hSNAP-23 wurde strukturbasierte rationale Mutagenese an LCA zur Generierung neuer Interaktionen durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass das Einbringen von negativ geladenen Seitenketten in den Positionen von Ser-143, Val-304 und Gly-305 die Aktivität gegen hSNAP-23 jeweils um etwa Faktor 3 steigerte. Als Methode zur Anpassung von LCA-Bindungstaschen an kritische hSNAP-23 Aminosäureseitenketten wurde ein Hefe-basiertes Selektionssystem eingesetzt, das für dieses Projekte adaptiert und optimiert wurde. Es erlaubt die Durchmusterung von LC-Mutantenbibliotheken, in denen durch systematische Mutation alle Aminosäurekombinationen mehrerer LC-Reste einer Bindungstasche vorliegen. Mit dem System konnten Mutationen in den Bindungstaschen für hSNAP-23 Prolin-182 und Lysin-206 identifizieren werden, die die proteolytische Aktivität von LCA gegenüber hSNAP-23 drastisch steigerten. Um eine effizient hSNAP-23 proteolysierende LCA zu erhalten, müssen weitere Bindungstaschen an hSNAP-23 adaptiert werden und sodann alle optimierten Bindungstaschen in einer LCA-Mutante zusammengefasst werden. Die gleiche Vorgehensweise wurde für die Anpassung der proteolytischen Aktivität von LCF an TI-VAMP angewendet. Mehrere wichtige TI-VAMP Aminosäurepositionen wurden identifiziert, die zur völligen Resistenz dieses SNAREs gegen BoNT beitragen. Das für die Identifizierung TI-VAMP spaltender LCF Mutanten etablierte Hefe-Selektionssystem wurde durch Verwendung einer kaum spaltbaren TI-VAMP Mutante insoweit sensitiver gemacht, dass wild-typ LCF keine, aber Mutanten-Bibliotheken von LCF-Bindungstaschen in „Screening“-Experimenten Klone lieferten, deren katalytische Aktivität gegen natives TI-VAMP nun untersucht wird.
Publications
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