Microevolution of pathogenic yeasts during interactions with the host immune system
Final Report Abstract
Evolution definiert sich nicht nur über artbildende Ereignisse und solche die bestehende Arten verschwinden lässt. Tatsächlich können evolutionäre Anpassungen in kleinerem Maßstab die menschliche Gesundheit maßgeblich beeinflussen zum Beispiel wenn Krankheitserreger Resistenzen gegen die Behandlung mit klinisch üblichen Medikamenten ausbilden. Ein ähnlicher Selektionsdruck wird durch das wirtseigene Immunsystem während Infektionen ausgeübt. Dies trifft auch auf opportunistische Krankheitserreger wie Candida-Spezies zu, die normalerweise als harmlose Kommensalen im Wirt vorkommen, aber auch kritische Erkrankungen in immunsupprimierten Individuen auslösen können. Um die Adaptabilität der häufigsten Erreger von Kandidosen (Candida albicans und Candida glabrata) in Konfrontation mit Makrophagen, essentiellen Komponenten des wirtseigenen Immunsystems, zu verifizieren, wurden im Rahmen unseres Projektes Mikroevolutionsexperimente durchgeführt. Tatsächlich ist für C. albicans bekannt, dass dieser Pilz aus phagozitierenden Immunzellen mittels Filamentierung ausbrechen kann. Der C. albicans-Mutante cph1Δ/efg1Δ fehlen jedoch zentrale Signalwege zur Ausbildung dieser Filamente. Daher entwickelten wir einen experimentellen Versuchsansatz um die evolutionären Beziehungen zwischen Wirt und Krankheitserreger zu studieren, im Speziellen die auftretenden Anpassungen nach kontinuierlicher Langzeitexposition von Mikroben mit Makrophagen in einem Zellkulturansatz. Innerhalb dieses Systems war die genannte nichtfilamenöse Mutante in der Lage ihre Filamentierungsfähigkeit zurück zu gewinnen, ebenso wie diverse Virulenz-assoziierte Eigenschaften. Der isolierte evolutionär veränderte Stamm (Evo) war wieder in der Lage aus Makrophagen auszubrechen und erlangte die Virulenz in einem Mausmodell wieder zurück Auch die transkripionelle Hochregulierung typischer Hyphen-assoziierter Gene, welche in der Ausgangsmutante cph1Δ/efg1Δ gestört war, reagierte wieder auf bekannte Umweltstimuli, was eine ausgeprägte transkriptionelle Neuvernetzung von Signalwegen im Evo Stamm nahelegt. Wir setzten uns zum Ziel die zugrunde liegenden genetischen Variationen für diese ungewöhnliche Adaption heraus zu finden und identifizierten eine „Missense“-Mutation mittels Genom- und Transkriptomsequenzierung als maßgebliche Ursache. Dieser einzelne Nukleotidaustausch im Gen SSN3, welches für eine Komponente des Cdk8-Moduls des Mediatorkomplexes codiert, war ausreichend um die beobachteten komplexen phänotypischen Veränderungen im Evo Stamm zu verursachen. Demnach waren wir in der Lage zentrale Transkriptionsfaktoren des komplexen Netzwerks der Filamentbildung mittels experimenteller Evolution zu umgehen und eine neue Ebene der transkriptionellen Regulation für dieses wichtige und gut-untersuchte Virulenzattribut von C. albicans aufzuzeigen. In vivo sind Pilzzellen während C. albicans-Infektionen oft in der Niere zu finden. Daher führten wir ein analoges Mikroevolutionsexperiment zum bereits beschriebenen Ansatz durch und infizierten Mäusenieren mit dem C. albicans-Parentalstamm, um den Pilz anschließend aus dem Nierengewebe zu isolieren. Nach mehreren aufeinanderfolgenden Passagen in der Niere, fanden wir nur wenige pilzliche Isolate mit phänotypischen Veränderungen, wohingegen sich die allgemeine Virulenz des Pilzes im Verlauf von acht Passagen nicht veränderte. Daher ist es naheliegend, dass der üblicherweise in mikrobiologischen Laboratorien eingesetzte C. albicans Parentalstamm bereits gut adaptiert ist um die Mausniere zu infizieren und dort zu persistieren. Im Gegensatz zu C. albicans, handelt es sich bei C. glabrata um einen nichtfilamentösen Pilz, der sich in Hefeform repliziert. Daher ist C. glabrata nicht in der Lage aus Makrophagen mittels Filamentierung auszubrechen sondern ist auf andere Überlebensstrategien angewiesen. Tatsächlich ist dieser Pilz daran angepasst Makrophagen-induzierten Stress zu tolerieren und repliziert intrazellulär in einem modifizierten phagosomalen Kompartiment. Ähnlich zu dem bereits beschriebenen C. albicans Experiment konfrontierten wir C. glabrata kontinuierlich für sechs Monate mit Makrophagen. Während dieser Zeit entwickelte C. glabrata einen genetisch stabilen, Pseudohyphen-ähnlichen Wachstumsphänotyp und der entstandene Stamm zeigte erhöhte Virulenz in verschiedenen Infektionsmodellen. Wir waren erneut in der Lage einen einzelnen Nukleotidaustausch, diesmal im Gen CHS2, welches für eine putative Chitinsynthase kodiert, als zu Grunde liegende genetische Ursache für diesen stark veränderten Wachstumsphänotyp zu identifizieren. Diese Ergebnisse ähneln jenen des C. albicans Makrophagenexperiments, da sich beide Male unter dem Selektionsdruck des Wirtes filamentöse Strukturen entwickelten, die genutzt wurden um aus dem Makrophagen auszubrechen. Neben unseren direkten Einblicken in die transkriptionelle und morphologische Wandelbarkeit dieser wichtigen Krankheitserreger erlauben diese Beobachtungen auch Schlussfolgerungen für die historische Evolution der Pathogenität von Pilzen. Zusammenfassend wurden in diesem Projekt erstmals evolutionäre Studien durchgeführt, welche unmittelbar Wirt- und Pilzinteraktionen widerspiegeln. Dieser Ansatz erlaubte uns bisher unbekannte Virulenzmechanismen unabhängig von bereits bestehenden Hypothesen zu identifizieren und erwies sich als überaus nützliches Werkzeug, um Interaktionen zwischen Wirt und Candida unabhängig von traditionellen Ansätzen zu beschreiben.
Publications
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Brunke S, Seider K, Fischer D, Jacobsen ID, Kasper L, Jablonowski N, Wartenberg A, Bader O, Enache-Angoulvant A, Schaller M, d’Entfert, Hube B
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