Funktionelle Charakterisierung des Leukämie-initiierenden AF4-MLL Komplexes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt ging es um die funktionelle Charakterisierung des AF4-MLL Fusionsproteins, das durch die chromosomale Translokation t(4;11)(q21;q23) entsteht. Diese Chromosomen- Translokation führt zur Bildung der beiden rezirpoken Fusionsgene MLL-AF4 und AF4-MLL. Die Expression der beiden Fusionsproteine geht mit der Entwicklung einer Akuten Lymphoblastischen Leukämie (ALL) einher. Diese spezielle Erkrankung wird dominant bei Säuglingen diagnostiziert (70% aller Säuglingsleukämien) und bei ca. 10% aller Kinder- und Erwachsenenleukämie. Im Mausmodell zeigte die alleinige Expression von AF4-MLL eine Leukämieentwicklung bei ca. 35% aller Mäuse. Alle Leukämiemäuse zeigten einen ALL Phänotyp und transkribierten AF4-MLL Transgen bei Diagnose, während die gesunden Mäuse (65%) keine Expression zeigten. Dies lag aber an einer zu niedrigen Infektionsrate mit unseren Retroviren (aufgrund der übergrossen Retroviren lag die MOI nur bei 0,001). Im Klartext: alle Mäuse mit transgenen Stammzellen, die unser AF4-MLL ins Genom integrieren konnten, entwickelten auch eine Leukämie. Deshalb wurde auch von uns der AF4-MLL Komplex gereinigt und funktionell charakterisiert. Dabei konnte wir zeigen, dass AF4-MLL durch die Endopeptidase Taspase1 in einen hochstabilen Proteinkomplex konvertiert wird, der praktisch wie ein dominant-positiver AF4 Komplex agiert. Der AF4 Komplex steuert normalerweise transkriptionelle Elongation indem er an RNA Polymerase II bindet und diese durch Phosphorylierung aktiviert; danach wird AF4 normalerweise rasch abgebaut. Es gibt jedoch eine kleine funktionelle Veränderung gegenüber dem Wildtypprotein AF4: so werden im transkribierten Bereich zusätzlich H3K4me3 Signaturen aufgebracht; dies entspricht aber einer Promotor-Signatur; deshalb hatten wir postuliert, dass Gene während ihrer Transkription durch die Anwesenheit von AF4-MLL praktisch in gigantische Promotoren verwandelt würden. Dies würde bedeuten, dass in Gegenwart von AF4-MLL über einen längeren Zeitraum hinweg, mehr und mehr benachbarte Gene im Genom reaktiviert werden könnten, was quasi einer Dedifferenzierung gleichkommt. Wir haben in diesem Projekt folgende Dinge in Teilbereich 1 erfolgreich bearbeitet: (1) Wir haben die Funktion der PHD Domäne untersucht und zeigen können, dass diese Domäne für das AF4-MLL Fuionsprotein eine essentielle Funktion besitzt. Teilbereiche dieser PHD-Domäne kontrollieren die onkogenen Funktionen von AF4-MLL; (2) Wir haben das Interaktom von AF4 und AF4-MLL im Detail untersucht und alle Protein-Protein-Interaktionen klassifizieren können; (3) wir haben ein neues Transposon-Vektorsystem etabliert, mit dessen Hilfe wir alle wichtigen Arbeiten zu diesem Projekt durchführen konnten (Teilprojekt 1 und 2). Dieses neue Vektorsystem erlaubte es uns, binnen einer Woche stabile Zellen nach einer Transfektion zu etablieren. (4) Dieses neues Vektorsystem wurde u.a. auch dazu verwendet, um zu zeigen, dass neben AF4-MLL noch weitere reziproke MLL Fusionen onkogenen Charakter besitzen; (5) wir haben auch die Endopeptidase Taspase1 studiert und seine Funktionen weiter aufgeklärt. Ohne Taspase1 wird das AF4-MLL Onkoprotein durch proteolytischen Abbau in der Zelle eliminiert. Wir konnten den Aktivierungsmechanismus für Taspase1 aufklären und eine dominant-negative Mutante von Taspase1 herstellen. Diese Arbeiten bergen ein grosses therapeutisches Potential, dass in zukünftigen Projekten bearbeitet werden soll. Im Bereich von Teilprojekt 2 ging es um die Auswirkungen des AF4-MLL Fusionsproteins auf die Epigenetik der Zelle, und damit auf Veränderungen des Transkriptoms. Die hierfür mit Verzögerung gewonnene Mitarbeiterin hat alle grundlegenden Arbeiten mit allen Kontrollen für dieses komplizierte Teilprojekt durchgeführt, neue Methoden etabliert und sich verschiedene Zellinien hergestellt, mit deren Hilfe es möglich war eine Reihe von wichtigen Untersuchungen durchzuführen. So konnte sie bereits zeigen, dass eine starke Expression von AF4-MLL sich advers auf das Langzeit-Überleben von Zellen auswirkt (sterben nach 4-6 Wochen). Also hat sie sich über Monate hinweg einzelne Zellklone erzeugt, sie molekular charakterisiert und als geeignet für unsere Fragestellungen eingestuft. Diese Zellklone exprimieren uninduziert AF4-MLL mit einem sehr geringen Expressionlevel. Alle 4 Klone können durch Doxycyclin induziert werden und verhalten sich dann auch für den gewählten Beobachtungszeitraum relativ physiologisch. Wir haben nun die ersten Transkriptionsstudien mit uninduzierten und induzierten Klonen durchführen können. Die Auswertungen dieser Daten sind leider noch nicht vollständig durchgeführt und müssen sowieso noch validiert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2013). An alternative splice process renders the MLL protein either into a transcriptional activator or repressor. Pharmazie 68, 601-607
Rössler T, Marschalek R
- (2014). Functional characterization of different MLL fusion proteins by using inducible Sleeping Beauty vectors. Cancer Letters 352, 196-202
Wächter K, Kowarz E, Marschalek R
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.canlet.2014.06.016) - (2015), AF4 and AF4N protein: recruitment of P-TEFb kinase, their interactome and potential functions. Am J Blood Res 5, 10-24
Scholz B, Kowarz E, Rössler T, Ahmad K, Steinhilber D, Marschalek R
- (2015). Optimzed Sleeping Beauty rapidly generate stable transgenic cell lines. Biotechnology J 10, 647-653
Kowarz E, Löscher D, Marschalek R
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/biot.201400821) - (2015). Unraveling the activation mechanism of Taspase1 which controls the oncogenic AF4- MLL fusion protein. EBioMedicine 2, 386-395
Sabiani S, Geppert T, Engelbrecht C, Kowarz E, Schneider G, Marschalek R
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2015.04.009)
