LC-ESI-MS/MS (Massenspektrometer)
Final Report Abstract
Durch die Kopplung des hier beschafften ESI-Hybrid-Massenspektrometers (im Folgenden kurz als ESI-MS/MS Gerät bezeichnet) mit einer nanoUPLC ist es möglich, sehr sensitiv und automatisiert Proteine aus hochkomplexen Proteingemischen nach vorheriger Fraktionierung und Proteolyse zu identifizieren und zu quantifizieren. Außerdem ist möglich, posttranslationale Modifikationen von Proteinen zu bestimmen und Peptide denovo zu sequenzieren. Letzteres ermöglicht die Durchführung eines proteogenomischen Ansatzes und ist immer dann von Interesse, wenn die Genomsequenz des Organismus nicht oder nicht vollständig zur Verfügung steht. Außerdem können damit Korrekturen an den aus der Genomsequenz vorhergesagten Proteinen vorgenommen werden. Im Berichtszeitraum wurde das Gerät hauptsächlich zur Identifikation und Quantifizierung von löslichen Proteinen aus Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Dinoroseobacter shibae, Leptospirillum und Bacillus megaterium genutzt. Hier war es zunächst erforderlich, die Protokolle zur Trennung und anschließenden Messung der Peptide für die entsprechenden Organismen zu optimieren. Zur Quantifizierung der Proteine kamen sowohl markierungsfreie Ansätze als Markierungsansätze zum Einsatz. Für S. aureus und D. shibae wurden metabolische Markierungsansätze etabliert, die es ermöglichen, die Proteine während der Kultivierung der Bakterien mit schweren oder leichten Isotopen zu markieren. Dazu war es erforderlich, die Bakterien in einem synthetischen Medium zu kultivieren, dem entweder Aminosäuren mit unterschiedlich schweren Isotopen (S. aureus) oder aber Ammonium in schwerer oder leichter Form (D. shibae) zugesetzt wurden. Das ESI-MS/MS Gerät weist eine ausreichend hohe Messgenauigkeit auf, um die zu erwartenden Massenunterschiede der Peptide zu detektieren. In den cytosolischen Proteinextrakten der Bakterien konnten bis zu 1600 Proteine zweifelsfrei identifiziert werden, wovon ca. 90% auch quantifizierbar waren. Ein besonderer Fokus lag hier insbesondere auf Proteinen, die sich bei der Adaptation an bestimmte Umweltbedingungen in ihren Mengen änderten und die somit funktionell unter diesen Bedingungen von entscheidender Bedeutung sein sollten. Als Bedingungen wurden hier solche ausgewählt, die relevant für das natürliche Habitat dieser Bakterien sind (z. B. erhöhte Harnstoffkonzentrationen und Temperaturerhöhungen von 32 auf 37°C bei S. aureus und verschiedene Formen des oxidativen Stresses bei D. shibae). Das Gram-negative, humanpathogene Bakterium P. aeruginosa ist fakultativ anaerob. Unter anaeroben Bedingungen ist es zur Nutzung von Nitrat als terminalem Elektronenakzeptor befähigt. In einer Kooperation mit der AG Jahn (Institut für Mikrobiologie) und der AG Jänsch (HZI) wurden zunächst Protokolle zur Darstellung des Membranproteomes in P. aeruginosa entwickelt. Anschließend wurden diese Protokolle genutzt, um die Zusammensetzung des Respirasoms unter denitrifizierenden Bedingungen zu untersuchen. Dabei wurden insbesondere die Protein-Protein-Wechselwirkungen im Dentrifikationskomplex aufgeklärt und ein Model des Komplexes abgeleitet. In Metaproteomanalysen eines Biofilms der sich auf einem Harnwegskatheder eines Patienten gebildet hatte, konnte gezeigt werden, dass dieser hauptsächlich von drei verschiedenen Bakterien dominiert wird: P. aeruginosa, Morganella morgani und Bacteriodes sp.. Unter diesen Bedingungen müssen sich offensichtlich alle Bakterien mit eisenlimitierenden Bedingungen auseinandersetzen. Die Anpassungsstrategien der Bakterien an die Nährstoffsituation bezüglich der vorhandenen C-Quellen waren jedoch deutlich unterschiedlich. Während P. aeruginosa z. B. oberflächenassoziierte Proteasen zur Nutzung von im Urin vorkommenden Proteinen als C- und Energiequelle synthetisierte, scheint M. morganii hauptsächlich Zucker zu nutzen. In diesem Ansatz identifizierte Wirtsproteine deuten auf eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems in Antwort auf den bakteriellen Biofilm bei dem Patienten hin. Posttranslationale Modifikationen an Proteinen haben einen ganz entscheidenden Einfluss auf die Aktivität von Proteinen und die Aussagen darüber, welchen Modifikationszustand ein Protein in der Zelle hat, sind von enormer Wichtigkeit für die Beurteilung des physiologischen Zustandes der Zelle. Dazu muss sichergestellt werden, dass die Präparationsmethoden keinen Einfluss auf den Modifikationszustand der Proteine haben. In einer Kooperation der AG Steinert (Institut für Mikrobiologie) und der AG Jänsch (HZI Braunschweig) wurde Lungengewebe aus Patienten mit Hilfe zweier Techniken fixiert: (i) der herkömmlichen Schockgefrierung und (ii) der HOPE-Fixierung (Hepes-glutamic acid buffer mediated organic solvent protection effect-fixation). Die unterschiedlich behandelten Gewebe wurden anschließend proteomisch untersucht. Dabei war ein hoher Grad der Übereinstimmung für die erhaltenen Ergebnisse sowohl in der Anzahl als auch im Spektrum der identifizierten Proteine und ihrer möglichen Phosphorylierungsstellen gefunden worden. Das lässt den Schluss zu, dass die HOPE-Fixierung im gleichen Maße wie die Schockgefrierung geeignet ist, um derartige Untersuchungen an Geweben und ähnlichen Patientenmaterialien vorzunehmen. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 2603 Proteinspezies und 3036 Phosphorylierungsorte identifiziert.
Publications
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