Spinning disk Mikroskopie-System für Lebendzellmikroskopie
Final Report Abstract
Eine zentrale Fragestellung unserer Arbeitsgruppe ist das Verständnis der Manipulation eukaryontischer Zellfunktionen durch Virulenzfaktoren bakterieller Infektionserreger. Hierzu wird das Modellsystem von Salmonella enterica eingesetzt, ein invasiver und fakultativ intrazellulärer Erreger. Unserer Arbeiten richten sich auf die Untersuchung der durch Salmonellen induzierten Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts von Wirtszellen während der Invasion, sowie des Vesikeltransports in Salmonellen-infizierten Wirtszellen und der Veränderungen des endosomalen Systems. Das spinning disk (SD) System ist als Mikroskop für die diversen Projekte der Abteilung Mikrobiologie mit Anforderungen an schnelle, multimodale und probenschonende Bildgebung konzipiert. Es werden Versuchsaufbauten eingesetzt, bei denen die Wirtszellen mit diversen Salmonellen-Stämmen infiziert und dann über längere Zeiträume beobachtet werden. Das SD-System verfügt über Lebendzellperipherie (Kontrolle von Temperatur, CO2, Luftfeuchtigkeit) und vollständige Motorisierung, die den programmgesteuerten, automatisierten Betreib erlaubt. Weiterhin ist das System mit einer Autofokus-Einrichtung zur Fokusstabilität bei langen Inkubationszeiten und einer Lasermanipulation für FRAP oder Photoaktivierung/Schaltung ausgestattet. Das System wird in einem S2 Laborbereich betrieben und erlaubt die Beobachtung von Infektionsvorgängen mit Erregern wie Salmonellen im lebenden System. Projektbereich A) untersucht die Veränderungen des eukaryontischen Zytoskeletts durch bakterielle Virulenzfaktoren Für die Beobachtung der hoch-dynamischen Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts während der Invasion von Salmonellen wurden Zelllinien mit transgener Expression von LifeAct-GFP hergestellt. Diese Zellen wurden für Infektionsversuche eingesetzt, bei denen die die Rolle von Salmonella- Effektorproteinen bei der Umsteuerung der Auslöschung von Mikrovilli bei polarisierten Zellen, und der nachfolgenden Umorganisation des Aktin-Zytoskeletts verfolgt wurden. Mittels des SD-Systems konnten die schnell ablaufenden Prozesse mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden und Datensätze für eine dreidimensionale Projektion einzelner Zellen wurden erzeugt. Projektbereich B) untersucht die Manipulation des Vesikeltransports durch Aktivitäten intrazellulärer Bakterien. Durch Einsatz von Zelllinien mit transgener Expression eines Fusionsproteins aus dem spätendosomalen/lysosomalen Membranprotein LAMP1 mit GFP können die Veränderungen des endosomalen Systems in infizierten Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verfolgt werden. Mit Einsatz der Photo-Manipulationseinrichtung wurden GFP-Fluoreszenz in definierten Bereichen infizierter Zellen gebleicht, und die Wiederherstellung der Fluoreszenz wurde in lebenden Zellen verfolgt. Diese Studien erlaubten es erstmals, die Zugänglichkeit des intrazellulären Lebensraums der Salmonellen, der ‚Salmonellacontaining vacuole‘ (SCV) für Nährstoffe zu verfolgen. Mit diesen Beobachtungen können nun die Anpassung eines intrazellulären Erregers an das Leben in Zellen und dessen Strategie zur Gewinnung von Nährstoffen für das intrazelluläre Wachstum erklärt werden. Diese Experimente werden nun weiter in Richtung Photoschaltung fluoreszenzmarkierter intrazellulärer Bakterien entwickelt. Hierdurch soll die Replikationsfähigkeit individuelle Bakterien in Wirtszellen abgefragt werden. In Projektbereich C) wird ein siRNA knockdown screen zur Identifizierung von Wirtszellfaktoren für die intrazelluläre Proliferation von Salmonellen durchgeführt. Nach siRNA knockdown von ca. 500 an zellulären Transportvorgängen beteiligter Wirtsfaktoren erfolgte die Infektion im 96-Kavitäten-Format und automatisierte Lebendzellmikroskopie über 8 Stunden. Es wurden 19 Wirtsfaktoren identifiziert, deren Inaktivierung zu einer intrazellulären Vermehrung von Salmonellen und Biogenese der SCV führen. Diese Proteine stellen somit Zielstrukturen für die Manipulation von Wirtszellen durch Salmonellen dar.
Publications
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