Charakterisierung und Interaktionen von Cathepsinen und assoziierten Proteinen des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus
Final Report Abstract
Da Cysteinproteasen bei parasitischen Helminthen Funktionen bei der Gewebewanderung, dem Nahrungsaufschluss sowie der Immunevasion wahrnehmen und daher essentiell für die parasitische Lebensweise sein können, sollten im bearbeiteten Projekt verschiedene Cysteinproteasen der Cathepsin- und Legumain-Gruppe des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus funktionell und bezüglich möglicher Interaktionen charakterisiert werden. In die Untersuchungen zu Interaktionen wurde ein Testican-ähnliches Thyroglobulin einbezogen, da für humanes Cathepsin L (CPL) eine Enzymhemmung durch dieses Thyroglobulin nachgewiesen wurde. Für die mittels Transkriptionsanalyse untersuchten Cysteinproteasen B1, B2, B3, F, Z und Legumain 1 und 2 sowie Testican ergab sich, dass die Proteine primär in den parasitischen Stadien und nur in sehr geringem Umfang in den frei-lebenden Stadien transkribiert werden. Eine Ausnahme bildete CPL, welches in allen Stadien, vorwiegend aber den frühen freilebenden Larvalstadien transkribiert wird. In die rekombinanten Expression wurden CPL, die B-Cathepsine, die Legumaine und Testican einbezogen. Bezüglich einer funktionellen Charakterisierung der Cysteinproteasen stehen Ergebnisse für CPB-1 noch aus, da die trans-Aktivierung dieses Enzyms erst kürzlich gelang. Für die anderen exprimierten Cysteinproteasen wurde festgestellt, dass alle ausschließlich im saurem Milieu arbeiten und ein Optimum bei pH 4,5 bzw. pH 5,5 aufweisen. Bezüglich der Substratspezifitäten entsprachen CPL sowie die Legumaine den aus der Literatur erwarteten Ergebnissen. Die B- Cathepsine zeigten hingegen eine höhere Affinität zum CPL- anstelle des CPB-spezifischen Substrats. Dies ist jedoch schon bei B-Cathepsinen anderer parasitischer Helminthen beobachtet worden und ist durch den molekularen Aufbau der jeweiligen aktiven Zentren erklärbar. Auch die Testung des Einflusses verschiedener Protease-Inhibitoren zeigte insgesamt die aus der Literatur erwarteten Ergebnisse. Eine Ausnahme bildete hierbei Leg- 2, dessen hohe Sensitivität gegenüber verschiedenen Cysteinproteaseinhibitoren nicht erwartet worden war. Dies weist darauf hinweist, dass es sich bei Leg-2 um einen eher untypischen Vertreter der Legumain-Gruppe handelt. Bei der Evaluierung potentieller natürlicher Substrate zeigten alle Proteasen die Fähigkeit, verschiedene bovine Proteine zu spalten. Bovines Kollagen I und II wurden dabei von allen Cysteinproteasen gespalten. Mit Ausnahme von Leg-2 spalteten die verschiedenen Proteasen zudem Bestandteile des Bronchialschleims, der dem Parasiten als Nahrungsgrundlage dient. Mittels in Kaninchen produzierter polyklonaler Antikörper konnten die Transkriptionsmusteranalysen auch auf Expressionsebene bestätigt werden. Zusätzlich zur stadienspezifischen Expression erfolgte auch eine Lokalisation der einzelnen Proteasen im Lungenwurmgewebe. Dabei zeigte sich, dass CPB-2 und -3 wie auch die Legumaine im Darm des Parasiten lokalisiert sind. Es kann daher von einer Funktion beim Verdau aufgenommener Nahrung ausgegangen werden. CPL, welches in nahezu allen Organen der Adulten sowie im Inneren von frei-lebenden Larven exprimiert wird, ist in Letzteren vermutlich am Umsatz von Speicherproteinen oder auch Häutungsvorgängen beteiligt, während bei der Umstellung auf die parasitische Lebendweise die Funktion einer unspezifischen lysosomalen Protease eingenommen werden könnte. Interaktionsversuche der Cathepsine mit dem Thyroglobulin Testican ergaben, dass Testican ein hochaffiner, reversibler, kompetitiver Inhibitor von CPB-3 ist, wobei die inhibitorische Wirkung aus einer Bindung an das aktive Zentrum von CPB-3 resultiert. Damit konnte bei Helminthen erstmalig eine Regulation von Cysteinproteasen durch Thyroglobuline nachgewiesen werden. Anders als beim Menschen erfolgt beim Rinderlungenwurm jedoch eine Regulation eines B-Cathepsin anstelle eines L-Cathepsins.
Publications
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Transkriptionsmuster von Cysteinproteinasen während der Entwicklung des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus. Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“, 02.-04.07.2012, Hannover
J. Korrell, T, Schnieder, C. Strube
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Charakterisierung der Enzymeigenschaften von Cysteinproteasen des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus. Tagung der DVG-Fachgruppe Parasitologie und Parasitäre Krankheiten, 08.-10.07.2013, Gießen
C. Haake, J. Korrell, C. Strube
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Transcriptional and functional characterization of cysteine proteases of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus. The 24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP), 25.-29.8.2013, Perth, Australien
C. Strube, J. Korell, C. Haake
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Charakterisierung von Cathepsin L des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus. Tagung der DVG-Fachgruppe Parasitologie und Parasitäre Krankheiten, 30.06.-02.07.2014, Leipzig
C. Haake, J. Korrell, D. Jordan, S. Schicht, C. Strube
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Charakterisierung von Cysteinproteasen der Cathepsin B-Subfamilie des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus. Tagung der DVG-Fachgruppe Parasitologie und Parasitäre Krankheiten, 30.06.-02.07.2014, Leipzig
D. Jordan, C. Haake, J. Korrell, C. Strube
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Legumaine sind Parasitismus-assoziierte Gene des bovinen Lungenwurmes Dictyocaulus viviparus. Tagung der DVG-Fachgruppe Parasitologie und Parasitäre Krankheiten, 30.06.-02.07.2014, Leipzig
J. Korrell, C. Haake, D. Jordan, S. Schicht, C. Strube
