3D-Struktur des Cannulae bildenden Proteins CanA des hyperthermophilen Archaeum Pyrodictium spec. in atomarer Auflösung
Final Report Abstract
Im vorliegenden Projekt wurde das aus Pyrodictium abyssi isolierten Protein CanA mit Hilfe unterschiedlicher analytischer und spektroskopischer Methoden strukturell charakterisiert und zusätzlich wurden methodische Arbeiten zur Verbesserung der NMR-Spektren und Resonanzlinienzuordnung durchgeführt. SSA (singular spectrum analysis) und ICA (independent component analysis) wurden zur Verbesserung der Qualität der n-dimensionalen NMR-Spektren verwendet und eine automatisierte Methode zur stereospezifischen Zuordnung von Seitenkettenamidprotonensignalen entwickelt. CanA ist ein Protein, das ein hitzebeständiges, nicht denaturierbares, organisches Hohlfasernetzwerk (Cannulae) bildet. Das Protein CanA bildet in Anwesenheit von divalenten Ionen bei Ionenkonzentrationen wie sie im Meerwasser vorliegen spontan Cannulae in vitro aus. Die generelle strukturelle Gleichheit des Polymers mit dem Monomer CanA konnte mittels Fourier-Transformations-Infrarotmessungen bewiesen werden. CanA unterliegt nicht nur einer ioneninduzierten Polymerisation, sondern auch einer langsam voranschreitenden Eigenpolymerisation. Daher war es für die Strukturaufklärung von größter Wichtigkeit, ein Konstrukt dieses Proteins zu entwickeln, welches bis auf die Polymerisierungsfähigkeit sämtliche strukturellen und physikalischen Eigenschaften von CanA beibehielt. Dieser Durchbruch gelang mit einem Konstrukt namens K1-CanA. Durch Circulardichroismus-Spektroskopie-Experimente konnte gezeigt werden, dass CanA und K1-CanA eine identische Sekundärstruktur (5% α-Helix, 41% β- Faltblatt, 53% coil) besitzen. Ein Vergleich der Amidsignale in den [1H,15N]-HSQC-Spektren von CanA und der Variante K1-CanA zeigt, dass die beiden Proteine eine nahezu identische 3D-Struktur haben. Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung konnte die Partikelgröße von monomeren CanA mit 3.38 nm bzw. 3.48 nm bestimmt werden. Diese Partikelgrößenverhältnisse bestätigten auch die durchgeführten NMR-Diffusionsmessungen, bei denen CanA als Monomer im nativen Zustand mit einem hydrodynamischen Radius Rh von 1.68 nm aufweist. Die Eigenpolymerisation, sowie die Polymerisierungseigenschaften von CanA zu Cannulae bzw. die nicht vorhandenen Polymerisationsfähigkeiten von K1-CanA, wurden durch Transmissions-Elektronenmikroskopie Messungen dokumentiert. Die aus rekombinantem CanA hergestellten Cannulae entsprachen in ihrer Form und den Dimensionen (Durchmesser ca. 30 nm) den natürlichen Cannulae im Netzwerk von Pyrodictium abyssi. Trotz der für die NMR kritischen Größe von 18.7 kDa des Proteins K1-CanA, wurden die NMR-Spektren mit Hilfe der 2D und 3D NMR Spektroskopie nahezu vollständig zugeordnet. Hierdurch konnten definitive Aussagen über die Sekundärstruktur des Proteins getroffen werden. Die über TALOS+ bestimmte Abfolge der Sekundärstrukturelemente von K1-CanA lautet βββαββββαββββββ (6% α-Helix, 44% β-Faltblatt und 50% coil). Anhand von (1H-15N-) sofast-HMQC-Spektroskopie-Messungen konnten die zur induzierten Polymerisation benötigten Ca2+ / Mg2+ Bindungsstellen identifiziert und die Bindungskonstanten bestimmt werden. Die Bindungsstellen befinden sich jeweils an den flexiblen Enden des β-Faltblatt-Barrels. Die Bindungsstelle 1 hat ein KD von 0,77 + 0.05 mM für Calcium und von 3,2 + 0,4 mM für Magnesium. Für Bindungsstelle 2 ist der KD für Calcium mit 10.7 + 2.2 mM größer derjenige für Magnesium mit 3,2 + 0.6 mM. Aus den gewonnenen NMR Daten wurden anschließend mit einer Moleküldyanmik mit Nebenbindungen (restrained molecular dynamics and simulated annealing) die räumliche Struktur bestimmt. Die Rekonstruktion der Cannulae-Struktur aus EM-Daten steht noch aus, sollte aber einfach sein, da die Interaktionsstellen der Monomere schon mit der NMR bestimmt werden konnten.
Publications
- (2011) Singular Spectrum Analysis for an Automated Solvent Artifact Removal and Baseline Correction of 1D NMR Spectra. J. Magn. Reson. 210, 177-183
De Sanctis, S., Malloni, W. M., Kremer, W., Tomé, A. M., Lang, E. W., Neidig, K. P. Kalbitzer, H. R.
- (2012) Independent component analysis (ICA) and singular spectrum analysis (SSA) for solvent artifact suppression in one-dimensional NMR spectroscopy: a comparative analysis. Trends Appl. Spectr. 9, 1-15
De Sanctis, S., Malloni, W. M., Kremer, W., Lang, E. W., Kalbitzer, H. R.
- (2014) Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung des Cannulae-bildenden Proteins von Pyrodictium abyssi. Dissertation Universität Regensburg
Kreitner, R. R.
- (2017) Stereospecific assignment of the asparagine and glutamine side chain amide protons in proteins from chemical shift analysis. J. Biomol. NMR 67, 157-164
Harsch, T., Schneider, P., Kieninger, B., Donaubauer, H., Kalbitzer, H. R.
(See online at https://doi.org/10.1007/s10858-017-0093-x)
