TIRF-Mikroskop
Final Report Abstract
Das Einzelmolekül-TIRF wurde in den ersten drei Jahren zunächst hauptsächlich zur Charakterisierung der Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der ATP-abhängigen DEAD-Box-Helikase eIF4A eingesetzt. eIF4A ist an der Entwindung von Sekundärstrukturen in der 5‘-nicht translatierten Region der mRNA während der Translationsinitiation beteiligt. Die RNA-abhängige ATPase- und ATP-abhängige Helikaseaktivität von eIF4A wird durch andere Translationsinitiationsfaktoren wie eIF4B und eIF4G reguliert. Wir haben eIF4A in seinen beiden Domänen mit Donor und Akzeptor-Farbstoffen markiert, und am N-Terminus biotinyliert, und auf Streptavidin-funktionalisierten Oberflächen immobilisiert, und Einzelmolekül-FRET-Experimente mittels TIRF-Mikroskopie durchgeführt. Dann haben wir die konformationelle Dynamik von eIF4A allein und in Anwesenheit von eIF4B, eIF4G, ATP und RNA untersucht. Wir konnten zeigen, dass eIF4A in Gegenwart von eIF4G nicht zwischen offenem und geschlossenem Zustand wechselt, wie andere Vertreter der DEAD-Box-Helikase-Familie, sondern zwischen einer halb-offenen und geschlossenen Form. Die Konformationsänderungen werden von eIF4B und eIF4G unterschiedlich beeinflusst. Beide Faktoren fördern die Population der geschlossenen Form. eIF4B beschleunigt vor allem das Schließen von eIF4A, wohingegen eIF4G insbesondere der C-Terminus, beide Konformationsänderungen stark beschleunigt. Aus unseren Messungen erhalten wir thermodynamische Information aus der Gleichgewichtsverteilung, und kinetische Information aus Ratenkonstanten, so dass sich Energieprofile konstruieren lassen. Unsere bisherigen Arbeiten zeigen, dass eIF4B und eIF4G, aber auch das RNA-Substrat die Energielandschaft der eIF4A- Konformationsänderungen modulieren, und so die ATPase- und Entwindungsaktivität stimulieren. Im weiteren Verlauf des Projekts soll der Einfluss des RNA-Substrats nun systematisch untersucht werden. Außerdem sollen diese Studien auf weitere Translationsfaktoren ausgedehnt werden, um so die Rolle von eIF4A als zentrales regulatorisches Element in der Translationsinitiation umfassend zu verstehen. In einem weiteren Projekt werden wir die Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus einer DNA-Topoisomerase, der DNA Gyrase, mittels Einzelmolekül-TIRF untersuchen. Ziel ist es, die Rolle von ATP-getriebenen Konformationsänderungen der Gyrase für die Topoisomerase-Aktivität zu entschlüsseln. Auch den Mechanismus der reversen Gyrase beabsichtigen wir mit diesem methodischen Ansatz zu untersuchen, um so die mechanistischen Unterschiede und Gemeinsamkeiten der ATP-abhängigen negativen (Gyrase) und positiven (reverse Gyrase) Superspiralisierung zu verstehen.
Publications
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(2014): eIF4B, eIF4G and RNA regulate eIF4A activity in translation initiation by modulating the eIF4A conformational cycle. Nucleic Acids Res. 42(12):7911-7922
Harms, U., Andreou, AZ, Gubaev, A, Klostermeier D
