Konfokales Einzelmolekül-Mikroskop
Final Report Abstract
Das konfokale Einzelmolekülmikroskop wurde in verschiedenen Projekten eingesetzt, um Konformationsänderungen von Helikasen und Topoisomerasen mittels Fluoreszenzresonanzenergietransfer zu untersuchen. Beispielsweise haben wir konformationelle Zustände der RNA-Helikase eIF4A und den Einfluss anderer Faktoren auf dessen Konformationszyklus untersucht, eIF4A ist eine DEAD-Box Helikase, die an der Translationsinitiation beteiligt ist und dort Strukturen in der 5‘-nicht translatierten Region der mRNA ATP-abhängig entwindet. DEAD-Box-Helikasen wechseln ATP-abhängig zwischen einer offenen, inaktiven und aktiven, geschlossenen Konformation. Wir konnten zeigen, dass eIF4A in Abwesenheit von RNA und ATP die offene Konformation einnimmt. Bei Bindung des Translationsfaktors eIF4G wird hingegen eine halb-offene Konformation induziert. Mithilfe des konfokalen Mikroskops konnten wir erstmals nachweisen, dass eIF4A in die aktive, geschlossene Konformation übergeht, wenn RNA und ATP sowie andere Translationsfaktoren wie eIF4B und eIF4G gebunden sind. Offensichtlich wird die geschlossene Konformation durch ATP- und RNA-Bindung weniger stabilisiert als das bei anderen Vertretern der DEAD-Box Helikasen der Fall ist. Diese Arbeiten haben erstmals gezeigt, dass Bindungspartner die Aktivität von DEAD-Box- Helikasen durch Einflussnahme auf den Konformationszyklus können. Wir haben ebenfalls mittels Einzelmolekül-FRET untersucht, ob RNA-Bindungsdomänen von DEAD-Box-Helikasen ihre Position relativ zum Helikase-Modul, das allen DEAD-Box-Helikasen gemeinsam ist, bei RNA-Bindung ändern. Diese Arbeiten werden sind derzeit noch nicht abgeschlossen. Weiterhin haben wir das Gerät zur Untersuchung der Konformationsänderungen von Topoisomerasen eingesetzt. So haben wir die Konformation des sogenannten N-gates der DNA-Gyrase mit FRET-Experimenten untersucht. Dabei ging es insbesondere um die Frage, was das Schließen des N-Tors triggert. Wir konnten zeigen, dass zum Schließen des N-gates Kalium-Ionen erforderlich sind, und dass die Bindung eines ATP-Moleküls ausreichend ist, obwohl zwei ATP-Bindungsstellen vorhanden sind. Diese Ergebnisse sind bisher noch nicht publiziert. Des weiteren konnten wir unter anderem mittels Einzelmolekül-FRET zeigen, dass ein C-terminaler tail der Gyrase ein autorepressives Element der Gyrase-Aktivität fungiert. Das konfokale Einzelmolekülmikroskop wird mittlerweile in einer Vielzahl von Projekten im Arbeitskreis eingesetzt.
Publications
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(2014) DEAD-box RNA helicases exhibit a continuum between complete functional independence of their domains and high thermodynamic coupling in nucleotide and RNA recognition. Nucleic Acids Res. 42(16):10644-54
Samatanga, B. & Klostermeier, D.
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(2014) Differential contributions of the latch in Thermotoga maritima reverse gyrase to binding of single-stranded DNA before and after ATP hydrolysis. Biol. Chem. 395(1): 83-93
Del Toro Duany, Y., Ganguly, A., Klostermeier, D.
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(2014) eIF4B and eIF4G jointly stimulate eIF4A ATPase and unwinding activities by modulation of the eIF4A conformational cycle. J. Mol. Biol. 426(1): 51-61
Andreou, A.Z. & Klostermeier, D.
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(2014) The acidic C-terminal tail of GyrA down-regulates the DNA supercoiling activity of B. subtilis gyrase. J. Biol. Chem. 289(18):12275-12285
Lanz, M.A., Farhat, M., Klostermeier, D.
