Degradation of the antiviral interferon-effector PKR by the virulence factor NSs of Rift Valley fever virus
Final Report Abstract
Das Rift Valley fever-Virus (RVFV; Familie Bunyaviridae) ist ein Mücken-übertragener Erreger in Afrika, der bei Menschen und Nutztieren schwere Erkrankungen auslösen kann. Ein wichtiger Virulenzfaktor des RVFV ist das Nichtstrukturprotein NSs, von dem bekannt war, dass es die antivirale Interferon (IFN)-Antwort unterdrückt in dem es die Wirts-mRNA-Synthese abschaltet. In der ersten Antragsperiode hatten wir reverse-Genetik-Systeme aufgebaut, mit deren Hilfe die Generierung rekombinanter Viren und Virus-like particles (VLPs), und die Messung der Polymerase-Aktivität (Minireplikon-Systeme) möglich wurden. Unsere damaligen Arbeiten ergaben zudem, dass das RVFV-Genom am 5‘-Ende eine Triphosphatgruppe (5’ppp) aufweist, welche den zytoplasmatischen Virus-Sensor RIG-I aktiviert. Schließlich konnten wir auch zeigen, dass NSs eine zusätzliche Funktion hat, es führt die antivirale Kinase PKR dem proteasomalen Abbau zu. Primäres Ziel unseres Projektes war es, den Mechanismus des NSs bei der Zerstörung der PKR aufzuklären. Um dies zu erreichen, suchten wir mit Proteomics-Methoden nach zellulären NSs-Interaktoren die dann auf ihre Beteiligung am PKR-Abbau durch NSs getestet wurden. Obwohl sich zeigte, dass keiner der Kandidaten diese Rolle innehat, konnten wir mit Hilfe unserer Interaktoren-Bank eine andere Funktion des NSs aufklären, die erst kürzlich bekannt wurde. NSs supprimiert die WirtsmRNA-Synthese, indem es den proteasomalen Abbau eines generellen Transkriptionsfaktors (TFIIH-p62) auslöst. Tatsächlich konnten wir einen unserer NSs-Interaktoren, die E3-Ubiquitin- Ligase FBXO3, als essentiell für diesen Vorgang identifizieren. NSs rekrutiert FBXO3 und programmiert es auf die Zerstörung des TFIIH-p62 um. FBXO3 ist ein Mitglied der Familie der sogenannten F-Box-Proteine, die den Target-spezifischen Anteil Bestandteil modularer E3- Ubiquitin-Ligasen darstellen. Eine weitere Komponente dieser F-Box-Komplexe ist Skp1, das ebenfalls essentiell für den NSs-vermittelten Abbau der TFIIH-p62 ist. Interessanterweise ist Skp1 - im Unterschied zu FBXO3 - auch notwendig, damit NSs die PKR zerstören kann. Den daraus resultierenden Verdacht, dass NSs dafür also ein anderes F-Box-Protein rekrutiert, konnten wir mit Hilfe eines breiten siRNA-screens erhärten und ein F-Box-Protein identifizieren, die das am PKR- Abbau durch NSs beteiligt ist. Unsere gegenwärtigen Arbeiten konzentrieren sich darauf, die molekularen Vorgänge auszuarbeiten. Weitere Ergebnisse aus dem Berichtszeitraum sind: ein reverse-Genetik-System zur spezifischen Untersuchung der Replikationsfunktion der RVFV- Polymerase, ein optimiertes VLP-Vakzin, ein Spezies-unabhängiger IFN-Bioassay, sowie Beiträge zu Studien über die Störung der DNA-Damage Response durch NSs und den antiviralen Effekt des IFN-stimulierten Proteins IFIT1. Das Projekt hat also zum besseren Verständnis der RVFV-Virulenz, Polymerase-Aktivität, und der Wirtszell-Reaktionen geführt, und zur Identifikation von Interaktoren und Mechanismen geführt, die für die zwei Schlüsselfunktionen der NSs-vermittelten Virulenz (proteasomaler Abbau von TFIIH und PKR) verantwortlich sind.
Publications
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