LC-MSMS Hybrid Forschungssystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die zentrale Forschungseinrichtung Metabolomics, assoziiert an das Institut für Pharmakologie der Medizinischen Hochschule Hannover, analysiert und quantifiziert endogene Stoffwechselprodukte mit einer molaren Masse zwischen 50 und 1.500 Da. Im Rahmen sogenannter targeted Metabolomics Untersuchungen erfolgt dabei die hochsensitive, simultane Quantifizierung vielfältiger, bekannter Metaboliten aus unterschiedlichen Spezies mittels Flüssigchromatographie-gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC-MSMS) (www.mhhannover.de/metabolomics.html). Die Spezifität der etablierten Methoden wird hierbei über die Analyse mehrerer spezifischer Fragmente der Vorläuferionen (MRM Modus, Analyse von Quantifier und Qualifier Ionen) gewährleistet. Sowohl zur Absicherung der Ergebnisse als auch vor allem zum Auffinden neuer Metaboliten als mögliche Biomarker (non-targeted Metabolomics) reicht jedoch die Massengenauigkeit von reinen Quadrupol-MS/MS Systemen nicht aus. Hierzu sind massengenauere und hochauflösende Massenspektrometer nötig. Im Rahmen des Programms „Forschungsgroßgeräte“ erfolgte im Jahr 2011 die Beschaffung eines LC-MSMS Hybridforschungssystems, bei dem seitens des Massenspektrometers die Kopplung von Quadrupolen (Q) und einem Flugzeit (TOF)-Analysator (QTOF) realisiert ist. Im Berichtszeitraum lag der wissenschaftliche Schwerpunkt auf folgenden Projekten: Identifizierung von zyklischen Nukleotiden: Die zyklischen Nukleosidmonophosphate cAMP und cGMP sind lange anerkannte second messenger, die eine Vielzahl von Funktionen regulieren. Das Vorkommen weiterer zyklischer Nukleotide in Mammaliazellen wurde bereits vor vielen Jahren postuliert, konnte aber aufgrund der einsetzbaren Nachweismethodik nicht zweifelsfrei bestätigt werden. Durch die Verwendung des QTOF-Massenspektrometers konnte sicher gezeigt werden, dass auch cCMP und cUMP in vivo gebildet werden können. Damit wurde der Weg geebnet, um deren Beteiligung an physiologischen bzw. pathophysiologischen Vorgängen näher zu untersuchen, um langfristig neue Therapieoptionen zu entwickeln. Unter Einsatz des QTOF-Systems wurde zudem die Bildung von 2´-Desoxy-cAMP (dcAMP) aus 2´-Desoxy-ATP durch eine rekombinante, humane lösliche Adenylylzyklase nachgewiesen. Bei der Analyse von Zell- bzw. Organextrakten zeigte sich jedoch aufgrund der hohen Massengenauigkeit des Geräts, dass in vivo ein von dcAMP unterscheidbarer Metabolit vorkommt (ca. 80 ppm Massendifferenz), dessen Molekülstruktur bisher noch nicht aufgeklärt ist. Damit stellt die Identifizierung endogener Metaboliten durch die QTOF-Technologie eine unabdingbare Voraussetzung für die sensitive Quantifizierung zyklischer Nukleotide mittels der etablierten Tandem-Massenspektrometrie dar. Dieses gilt gleichermaßen für laufende Untersuchungen zur Funktion von 2´,3´-zyklischen Nukleotiden. Veränderungen im Metabolitenmuster beim Lesch-Nyhan Syndrom: Das Lesch-Nyhan Syndrom ist eine x-chromosomal vererbte Erkrankung, die auf einer verringerten Expression/Aktivität der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) beruht. Unter Verwendung einer HPRT-negativen Neuroblastomzelllinie und HPRT-knockout Mäusen wurde sowohl ungerichtet (non-targeted) als auch gezielt (targeted) nach veränderten Metabolitenvorkommen gesucht. Dabei konnten Unterschiede im Vorkommen bekannter nukleosidischer Metaboliten, einzelner Lipidspezies und Neurotransmitter bestimmt werden, als auch die Existenz einer Reihe differentiell regulierter Metaboliten nachgewiesen werden, die bisher in den vorhandenen Datenbanken noch nicht niedergelegt sind. Insgesamt hat das LC-MSMS Hybridforschungssystem dazu beigetragen, dass 1. die Existenz neuer Signalmoleküle (cCMP, cUMP) zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte; 2. falsch-positive Quantifizierungen von zyklischen Nukleotiden (dcAMP) vermieden wurden; 3. in non-targeted Metabolomics Ansätzen in Modellsystemen zur Untersuchung des Lesch-Nyhan Syndroms (Zellkultur, knock-out Maus) Veränderungen identifiziert werden konnten, die Hinweise auf neue Therapieoptionen bei dieser seltenen Erbkrankheit liefern.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2´-deoxy-cAMP in human cell lines: Another second messenger? Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 385 (Suppl 1) S9 (2012) (Abstract)
Beckert C, Hinz C, Beste KY, Burhenne H, Schwede, F, Seifert R, Kaever V
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cCMP, cUMP, cTMP, cIMP and cXMP as possible second messengers: development of a hypothesis based on studies with soluble guanyly cyclase α(1)β(1). Biol Chem 394, 261-270 (2013)
Beste KY, Seifert R
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cAMP, cGMP, cCMP and cUMP concentrations across the tree of life: High cCMP and cUMP levels in astrocytes. Neurosci Lett 579, 183-187 (2014)
Hartwig C, Bähre H, Wolter S, Beckert U, Kaever V, Seifert, R
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Measurement of 2´,3´-cyclic nucleotides by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in cells. J Chromatogr B 964, 108-211 (2014)
Bähre H, Kaever V
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Non-targeted Metabolomics in a cell model for Lesch-Nyhan Syndrome. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 387 (Suppl 1) S97 (2014) (Abstract)
Tschirner, SK, Bähre H, Seifert R, Kaever V
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Nucleotidyl cyclase activity of soluble guanylyl cyclase in intact cells. Biochim Biophys Res Commun 443, 1195-1199 (2014)
Bähre H, Danker KY, Stasch J-P, Kaever V, Seifert R
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cCMP and cUMP occur in vivo. Biochim Biophys Res Commun 460, 909-914 (2015)
Bähre H, Hartwig C, Munder A, Wolter S, Stelzer T, Schirmer, B., Beckert, U., Frank, DW, Tümmler B., Kaever, V., Seifert, R
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cCMP and cUMP: emerging second messengers. Trends Biochem Sci 40, 8-15 (2015)
Seifert R
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From canonical to non-canonical cyclic nucleotides as second messengers: pharmacological implications. Pharmacol Ther 148, 154-184 (2015)
Seifert R, Schneider E, Bähre H
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Report of the Third Symposium „cCMP and cUMP as New Second Messengers“. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 388, 1-3 (2015)
Schneider EH, Seifert R
