Metabolic control analysis of microbial fed-batch production of L-tryptophan
Final Report Abstract
Die Effizienz biotechnologischer Produktionsprozesse ist oft limitiert durch regulatorische Mechanismen auf zellulärer Ebene, die einerseits die spezifischen Produktbildungsraten und andererseits auch die Gesamtdauer der Produktionsprozesse beeinflussen. Dies ist zurückzuführen auf die Einbettung der Synthesewege von Zielmolekülen in den Gesamtstoffwechsel der Zelle. Eine gezielte Stammoptimierung erfordert daher ein quantitatives Verständnis der in der Zelle ablaufenden Stoffwechselvorgänge im Produktionsprozess, üblicherweise ein Zulaufverfahren im Rührkesselreaktor. In diesem Projekt wurden metabolische Kontrollanalysen von rekombinanten E. coli zur L-Tryptophan-Produktion aus Glycerin und Ammoniak im Rührkesselreaktor durchgeführt. Zur Untersuchung des komplex regulierten L-Tryptophan-Biosynthesewegs wurde der Zellstoffwechsel zu einem ausgewählten Prozesszeitpunkt des Zulaufverfahrens in einer parallelisierten metabolischen Analyse durch veränderte Substratzufuhr in Kurzzeitexperimenten ausgelenkt und die Reaktion der Zellen mittels analytischer (Fluxom, Metabolom) und theoretischer Methoden (MCA) erfasst. Für die mikrobielle Herstellung von L-Tryptophan wurde ein Zulaufprozess in einem Rührkesselreaktor im 15 L Maßstab mit Glycerin als Kohlenstoffquelle etabliert. Die von der AG Sprenger bereitgestellten rekombinanten L-Tryptophanproduzenten wurden in diesem standardisierten Zulaufverfahren eingesetzt und reaktionstechnisch charakterisiert. Um bei den metabolischen Analysen in Kurzzeitexperimenten mit Zellen aus dem Produktionsprozess auch nicht-natürliche Kohlenstoffquellen verwenden zu können, wurden Transporterproteine (Organophosphat-Antiporter) in die zu analysierenden Produktionsstämme integriert. Zur unmittelbaren starken Auslenkung des metabolischen Fließgleichgewichtes während der Kurzzeitanalysen wurden die natürlichen Substrate Glucose, Glycerin, Pyruvat und Succinat verwendet. Um eine gezielte Auslenkung im Aromatenbiosyntheseweg zu ermöglichen, wurden darüber hinaus auch Kurzzeitanalysen mit dem nicht-natürlichen Substrat Shikimat durchgeführt. Ein Vergleich der beiden L-Tryptophan-Produktionsprozesse mit und ohne Shikimattransporterstamm zeigte keine Beeinflussung des Prozessverlaufs durch die Integration des Transportergens. Für die Kurzzeitanalysen mit dem Shikimattransporterstamm wurden die Substrate Glucose und Glycerin, sowie die Kombination der Substrate Glucose und Shikimat beziehungsweise Glycerin und Shikimat gewählt. Für die Kurzzeitanalysen wurden jeweils vier Stunden nach Induktion Zellen aus dem Produktionsreaktor entnommen und mittels der Methodik des schnellen Mediumswechsels in vier parallele Analysenreaktoren überführt. Durch variierende Substrate und Substratzulaufraten wurde das metabolische Fließgleichgewicht der Zellen in unterschiedliche Richtungen ausgelenkt, wodurch in beiden Analysen 12 metabolische Gleichgewichtszustände innerhalb von 20 Minuten Versuchszeit eingestellt und analysiert wurden. Die gemessenen extrazellulären Stoffflussraten und intrazellulären Metabolomdaten dienten zur Abschätzung intrazellulärer Stoffflussverteilungen und ermöglichten thermodynamische Analysen der Reaktionsnetzwerke. In Kombination mit stochastischen Methoden der metabolischen Kontrollanalyse (MCA) konnten die intrazellulären Limitierungen im Stoffwechsel der Zellen aus dem Produktionsprozess bestimmt werden. Die aus der MCA abgeleiteten Vorschläge für die genetischen Verbesserungen waren Überexpressionen der Gene glpX, prsA, serB, aroB, igps und trpB. Die Proteomanalytik zu einem Referenzlauf der Tryptophansynthese zeigte in den Perturbationsexperimenten keine wesentlichen Veränderungen in der Proteinzusammensetzung, was den Tryptophanstoffwechsel angeht. In den Transkriptanalysen (RNA-Seq bzw. qPCR ausgewählter Gene) wurden einigen literaturbekannte Veränderungen bestätigt (z.B. Abnahme der Transkription von Genen des Glycerinstoffwechsels in Glukose-Reaktoren); andere Transkriptänderungen führten zu neuen Stammkonstruktionen um z.B. limitierende Schritte aufzuheben. Die aus der MCA abgeleiteten genetischen Veränderungen wurden erfolgreich in den Referenzstamm integriert und die neuen Stämme wurden reaktionstechnisch im standardisierten Produktionsverfahren charakterisiert. Mit E. coli NT1259 trpBA igps wurde eine maximale L-Tryptophan-Konzentration von 21,93 g L^-1 erreicht. Dies entspricht einer Steigerung der maximalen Produktkonzentration um 28,9% gegenüber dem ursprünglichen Referenzstamm.
Publications
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Metabolische Analysen zur Herstellung aromatischer Aminosäuren mit Escherichia coli im Zulaufverfahren. Disseration TUM
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