Function of Drosophila Tbx1 (Org-1)
Final Report Abstract
Die Abundanz von Transkript und Protein des T-box Gens org-1 in der Drosophila Flügelimaginalscheibe ist äußerst gering. Dennoch hatten erste knockdown Versuche mit org-1-RNAi phänotypische Konsequenzen gezeigt. Hier wurde nachgewiesen, dass diese Phänotypen mit zwei verschiedenen org-1-RNAi-Konstrukten erhalten werden konnten, dass sie durch Koexpression von UAS-org-1 (aber nicht von UAS-GFP) abgeschwächt wurden und dass sie mit einer Reduktion der Org-1 Proteinexpression einhergingen. Mit verschiedenen Gal4-Treibern waren die Phänotypen ähnlich zu denen, die bei abgeschwächter Aktivität des Notch (N) Signalweges erhalten wurden. Dabei war N in all seinen Funktionen in der Flügelimaginalscheibe betroffen: laterale Inhibition bei der Neurogenese, Spezifikation der Dorso-Ventral-Grenze und Festlegung der Breite der Longitudinalvenen. Wir zeigten, daß org-1-RNAi die Konzentration von N reduziert. Dieser Effekt war mit Antikörpern gegen N-intra und N-extra nachweisbar. In Folge war die Expression von N Zielgenen wie wingless und cut abgeschwächt. Reduktion der N-Signalweg Aktivität hatte keinen Einfluss auf die Org-1 Expression. Die Phänotypen von org-1 knockdown waren nicht deckungsgleich mit Hypomorphie im N Signalweg. Insbesondere zeigte sich nur bei org-1 knockdown massiver Zelltod mit den üblichen Konsequenzen wie baso-laterale Kontraktion kolumnärer Zellen, Penetration der Basalmembran (extrazelluläre Matrix) und Motilität sterbender Zellen. Koexpression von p35 oder bskDN unterdrückte die Apoptose-Phänotypen, beeinflusste aber nicht die Reduktion der N-Signalweg Aktivität. Die Koexpression verschiedener T-box Gene in vielen Zellen der Drosophila Flügelimaginalscheibe (omb, Doc, mid, org-1) stellt die Frage nach der regulatorischen Spezifität. Alle T-box Proteine selektieren in vitro sehr ähnliche Sequenzen. Es ist daher wahrscheinlich, dass Kofaktoren für die Spezifität notwendig sind. Wir haben dreißig Enhancer mit konservierten hoch-affinen T-box binding elements (TBE) aus flügelrelevanten Genen in enhancer reporter Vektoren kloniert und transgen gemacht. Ihre Omb-Abhängigkeit wurde bereits getestet. Für Org-1 läuft noch ein ChIP-Seq Experiment. Nach Vorliegen der Daten soll die Org-1 Abhängigkeit relevanter Enhancer getestet werden.
