Generierung lentiviral-kodierter randomisierter si/shRNA-Bibliotheken zur funktionellen Genanalyse in hämatopoetischen Zellen
Final Report Abstract
Ziel unseres Forschungsvorhabens war die Klonierung lentiviraler randomisierter si/shRNA – Bibliotheken, mit deren Hilfe die Expression jedes beliebigen Gens in murinen und humanen Zellen durch RNA-Interferenz reduziert werden kann, sowie deren funktionelle Evaluation in hämatopoetischen Zelllinien. Ausgehend von einer Methode, die mit Hilfe von enzymatischen Restriktionsverdauen zellulärer cDNA funktionelle si/shRNAs generiert wurde die Herstellung einer randomisierten shRNA-Bibliothek optimiert, deren Produkte initial als nicht-virale Expressionsplasmide in Bakterienstocks stabil erhalten und amplifiziert werden können. Diese shRNA-Bibliothek kann anschließend direkt in lentivirale Vektoren kloniert werden, wobei die Ausbeute allerdings nur bei etwa 3x10^6 Klonen/1µg eingesetztem DNA-Oligonukleotid liegt. Limitierend für ein molekularbiologisch orientiertes Routinelabor sind dabei zum einen die in jedem einzelnen Syntheseschritt erreichbare Komplexität der Bakterienklone. Dieses Problem erscheint aber repetitiv oder durch z.B. industrielle Produktion prinzipiell lösbar und lieferte eine stabile und einfach zu amplifizierende randomisierte Bibliothek. Problematisch bleibt der nächste Schritt der Klonierung der Bibliothek in lentivirale Vektoren, während deren Einsatz und die Identifizierung von RNAi-Zielgenen in Zellkulturen unproblematisch erscheint. Die „Schritt für Schritt“ Optimierung und der anschließende Nachweis der Funktion generierter shRNA-Sequenzen erfolgte mit Hilfe einer bekannten si/shRNA Sequenz, die gegen die GFP mRNA („Green Fluorescent Protein“) gerichtet ist. Nach Klonierung in ein lentivirales Transgenplasmid wurden hochtitrige virale Überstände hergestellt und hämatopoetische BaF3/GFP+ Zellen, die stabil GFP exprimieren, transduziert. Anhand von FACS- und Western Blot-Analyse konnte die effektive Reduktion von GFP nachgewiesen werden. Anschliessend wurde die Herstellungsmethode optimiert und eine randomisierte si/shRNA Bibliothek hergestellt, von der hochtitrige lentivirale Überstände zur Transduktion einer faktorabhängigen (IL-3) hämatopoetischen Zelllinie (32D) eingesetzt wurden. Nach Entzug von IL-3 wurden Faktor-unabhängige Zellklone isoliert und die kodierten si/shRNA-Sequenzen mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Durch Sequenzabgleich konnten zelluläre Zielgene wie z.B. BCAP, Hspa2 und Fn3k identifiziert werden, deren Effekte und funktionelle Bedeutung für IL- 3 unabhängige Proliferation analysiert wurde. So ergab genspezifische RNAi von BCAP z.B. eine etwa 95%ige Reduktion des BCAP Proteins im Western Blot, was jedoch nicht mit Faktor-unabhängigem Wachstum transduzierter 32D Zellen einherging. Eine gezielt generierte lentivirale randomisierte si/shRNA-Bibliothek kann trotz Limitationen in der Komplexität von großem Nutzen für funktionelle Genanalysen jeden beliebigen Gens in eukaryontischen Zellen sein, insbesondere wenn diese nur schwer retroviral zu transduzieren sind wie z.B. hämatopoetischen Stammzellen, sein.
