Generierung lentiviral-kodierter randomisierter si/shRNA-Bibliotheken zur funktionellen Genanalyse in hämatopoetischen Zellen

• Applicant: Professorin Dr. Michaela Scherr
• Subject Area: Hematology, Oncology
• Term: from 2006 to 2021
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 18898229

Die Entwicklung von Methoden zur Induktion von RNA-Interferenz (RNAi) ermöglicht funktionelle Genanalysen in einer Vielzahl von Organismen. Neben der Inhibition der Expression individueller Gene sind bereits genomweite Funktionsanalysen mittels RNAi in C. elegans und in Säugerzellen beschrieben. Dabei benötigen ¿Gene silencing¿- Studien in Säugerzellen die dauernde Anwesenheit des RNAi-Triggers in der Zelle, was durch eine Pol III-Promotor-vermittelte Transkription von si/shRNAs erreicht werden kann. Kürzlich wurden erstmals Strategien zur Klonierung randomisierter si/shRNA-Bibliotheken, deren Expressionskassetten in retrovirale Transgenplasmide kloniert wurden, beschrieben. Ziel unseres Antrages ist die Klonierung lentiviraler randomisierter si/shRNA - Bibliotheken und deren funktionelle Evaluation. Wir werden, ausgehend von semi-randomisierten Oligonukleotiden, eine randomisierte (si/)shRNA-Bibliothek herstellen, die entsprechenden Expressionskassetten in lentivirale Vektoren klonieren, Virusüberstände herstellen und diese zur Transduktion Faktor-abhängiger hämatopoetischer Zelllinien verwenden, die unter geeigneten Kulturbedingungen die Positivselektion genetisch modifizierter Zellen und die Charakterisierung der exprimierten si/shRNA-Sequenzen erlaubt. Eine lentivirale randomisierte si/shRNA-Bibliothek wird von großem Nutzen für funktionelle Genanalysen in für retrovirale Transduktion schwer zugänglichen Zielzellen wie z.B. hämatopoetischen Stammzellen sein.

• DFG Programme: Research Grants
• Participating Person: Professor Dr. Matthias Eder