Untersuchung der molekularen Grundlagen mitotischer nicht-allelischer homologer Rekombination am Beispiel der Typ-2 NF1 Deletionen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des Projekt konnten wir nachweisen, dass Typ-2 NF1 Deletionen durch mitotische, intrachromosomale nicht-allelische homologe Rekombination (NAHR) während der frühen Embryonalentwicklung entstehen. Wir schließen dies aus der Beobachtung, dass die Typ-2 Deletionen bei betroffenen Patienten in zellulären Derivaten aller drei Keimblätter nachzuweisen sind. Die Mosaikbildung mit normalen Zellen bei den betroffenen Patienten spricht für einen postzygotischen Ursprung der Typ-2 NF1 Deletionen. Im Anschluss an dieses Teilprojekt haben wir die Bruchpunkte der Typ-2 NF1 Deletionen, die durch mitotische NAHR entstanden sind, detailliert untersucht. Wir stellten fest, dass diese nicht in NAHR Hotspots lokalisiert sind, die nur wenige Kilobasen an DNA umspannen. Damit konnten wir einen klaren Unterschied zur meiotischen NAHR in der NF1 Region nachweisen, die zur Entstehung der Typ-1 NF1 Deletionen führt. Bei meiotischer NAHR sind die Bruchpunkte in Hotspots lokalisiert und werden durch gezielt positionierte DNA Doppelstrangbrüche hervorgerufen. Bei mitotischer NAHR, die zur Entstehung von Typ-2 NF1 Deletionen führt, ist dies nicht der Fall. Wir stellten jedoch fest, dass auch die Bruchpunkte der Typ-2 NF1 Deletionen nicht ganz zufällig lokalisiert sind. Sie liegen innerhalb der segmentalen Duplikationen SUZ12 und SUZ12P gehäuft im Bereich von kurzen Sequenzmotiven, die nicht-B DNA Sequenz-Konformationen einnehmen können bzw. die empfindlich sind gegenüber Stress-induzierter DNA-Duplex Destabilisierung. Neben diesem wichtigen Unterschied hinsichtlich der Hotspot-Lokalisation von NF1 Deletions-Bruchpunkten, die aus meiotischer oder mitotischer NAHR hervorgehen, konnten wir auch Gemeinsamkeiten zwischen beiden Mechanismen feststellen. Die ausführliche Analyse der Bruchpunkt-flankierenden Sequenzen bei Typ-1 und Typ-2 NF1 Deletionen zeigte, dass sowohl mitotische als auch meiotische NAHR Ereignisse in der NF1 Region mit kontinuierlicher Genkonversion einhergehen. Dies bedeutet, dass in den Heteroduplex-Bereichen der Rekombinations-Intermediate immer sehr exakt ein bestimmter DNA-Strang zur Mismatch-Reparatur verwendet wird. Damit erweist sich der NAHR Mechanismus im Prinzip als ein sehr exakter Reparaturmechanismus von DNA- Doppelstrangbrüchen. Da jedoch bei NAHR eine nicht-allelische Template-DNA verwendet wird, entstehen dennoch Genom-Rearrangements, wie Deletionen, und es ist damit ein mutagener Prozess. Die Analyse der Genkonversionsmuster bei Typ-2 NF1 Deletionen hat auch gezeigt, dass die Rekombinations-assoziierte Mismatch-Reparatur unter Umständen ausbleiben kann und es zur post-mitotischen Segregation (PMS) von nicht reparierten Rekombinations- Intermediaten (Chromatiden) kommt. Dies wiederum verursacht Bruchpunkt-Heterogenität und die Anwesenheit von unterschiedlichen Deletions-tragenden Chromosomen. Wir konnten dies bei einem Patienten mit einer Typ-2 NF1 Deletion nachweisen. Dieser Patient wies zwei unterschiedliche Deletions-Chromosomen 17 auf, bei welchen die Bruchpunkte der Deletion 1.4-kb voneinander getrennt lokalisiert waren. Zusätzlich konnten wir normale, nicht-deletierte Zellen im Körper des Patienten nachweisen, was den postzygotischen Ursprung der Deletion belegt. Dies war ein nicht erwartetes Ergebnis unserer Analysen und ist in dieser Form beim Menschen noch nicht beschrieben worden. Da sich NAHR-assoziierte PMS auch während der Meiose ereignen kann, ist dieser Mechanismus unbedingt zu berücksichtigen bei der Analyse von NAHR-mediierten Rearrangements, denn er kann zu Bruchpunkt-Heterogenität und Mosaikbildungen führen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Identification of recurrent type-2 NF1 microdeletions reveals a mitotic nonallelic homologous recombination hotspot underlying a human genomic disorder. Hum Mutat. 2012 Nov;33(11):1599-609
Vogt J, Mussotter T, Bengesser K, Claes K, Högel J, Chuzhanova N, Fu C, van den Ende J, Mautner VF, Cooper DN, Messiaen L, Kehrer-Sawatzki H
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Tissue-specific differences in the proportion of mosaic large NF1 deletions are suggestive of a selective growth advantage of hematopoietic del(+/-) stem cells. Hum Mutat. 2012 Mar;33(3):541-50
Roehl AC, Mussotter T, Cooper DN, Kluwe L, Wimmer K, Högel J, Zetzmann M, Vogt J, Mautner VF, Kehrer-Sawatzki H
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Analysis of crossover breakpoints yields new insights into the nature of the gene conversion events associated with large NF1 deletions mediated by nonallelic homologous recombination. Hum Mutat. 2014 Feb;35(2):215-26
Bengesser K, Vogt J, Mussotter T, Mautner VF, Messiaen L, Cooper DN, Kehrer- Sawatzki H
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Population-specific differences in gene conversion patterns between human SUZ12 and SUZ12P are indicative of the dynamic nature of interparalog gene conversion. Hum Genet. 2014 Apr;133(4):383-401
Mussotter T, Bengesser K, Högel J, Cooper DN, Kehrer-Sawatzki H
