Mechanismus des durch HLA-DM und kleine Moleküle vermittelten MHCII:Peptid-Austausch

• Applicants: Professor Dr. Christian Freund; Dr. Ronald Kühne
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 2011 to 2015
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 186308555

Die intrazelluläre Beladung von MHC Klasse II (MHCII) Molekülen mit Peptid- Fragmenten pathogenen Ursprungs und deren Präsentation auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen (APC) gehört zu den wichtigsten Auslösern der adaptiven Immunantwort. Die mit dem CLIP-Peptid vorbeladenen MHC Klasse II Proteine treffen im sauren Milieu später endosomaler Vesikel auf „fremde“ Peptide. Das Protein HLA-DM (DM) katalysiert dort den Austausch von CLIP gegen antigenes Peptid mit höherer Affinität. HLA-DM ist den MHC Klasse II Proteinen strukturell weitgehend homolog. Im Gegensatz zu den MHCII Molekülen, ist HLA-DM (DM) nicht in der Lage Peptide zu binden. Neben DM katalysieren auch einige kleine organische Moleküle die Peptid-Beladung. Während DM ausschließlich im sauren Milieu endosomaler Vesikel aktiv ist, entfalten viele der sogenannten „MHC Loading Enhancer“ (MLE) ihre Wirkung unabhängig vom pH-Wert und allelspezifisch am auf der Zelloberfläche präsentierten MHCII. Im Rahmen des beantragten Projekts möchten wir den Mechanismus der MHCII Peptid-Beladung mit Hilfe von NMR-Spektroskopie, ortsspezifischer Mutagenese und Modellierung dieses dynamischen Prozesses aufklären. Es wird die Beladung des MHCII Allels HLA-DR1 (DR1) mit dem CLIPPeptid sowie dessen Austausch gegen das höher affine Hämagglutinin (HA) Peptid in Gegenwart von DM beziehungsweise von bereits bekannten kleinen Molekülen mit MLE-Aktivität untersucht. Isotopen-Markierung der einzelnen Ketten sowie einiger Aminosäure-Typen des MHCII a/b Heterodimers wird zur NMR-Resonanzzuordnung strukturell wichtiger Regionen führen. In CLIP/HA Austauschexperimenten werden wir Änderungen der chemischen Verschiebung, der Wasserstoff-Deuterium-Austausch- Raten und NMR-Relaxationszeiten von wichtigen Protein- und Peptid-Resonanzen analysieren. Auf diese Weise können kinetische, strukturelle und dynamische Veränderungen, die den Peptid-Austausch begleiten, auf atomarer Ebene verfolgt werden. Diese experimentellen Daten fließen in Moleküldynamiksimulationen ein, die zum Ziel haben, den Austauschprozess im Detail abzubilden sowie strukturelle Hypothesen zu generieren, die dann experimentell überprüft werden. In Kombination mit einer Mutationsanalyse beteiligter Reste soll sowohl der Mechanismus des natürlichen, DM vermittelten, als auch des durch kleine Moleküle beschleunigten Peptidaustauschs bei MHCII Proteinen untersucht werden. Hohe Priorität hat die Aufklärung molekularer Mechanismen, die zur Bildung und Auflösung des MHCII/DM Komplexes entscheidend beitragen. Die durch DM beeinflussten Konformationen des zum Peptidaustausch befähigten MHCII sind Ausgangspunkt weiterführender Untersuchungen sowohl zur Aufklärung des Wirkmechanismus bekannter MLE als auch zur Entwicklung neuer, effizienter, selektiv wirksamer MLE.

• DFG Programme: Research Grants