Methyltransfer reactions in the reductive acetyl-Coenzym A pathway
Metabolism, Biochemistry and Genetics of Microorganisms
Structural Biology
Final Report Abstract
Der reduktive Acetyl CoA-Weg ist ein autotropher Stoffwechselweg, in dem zwei Moleküle CO2 reduziert und zu Acetyl-CoA kondensiert werden. Wir untersuchten zwei Enzyme des reduktive Acetyl CoA-Weges aus Carboxydothermus hydrogenoformans: (I.) Untersuchten wir den Mechanismus der ATP-abhängigen reduktiven Aktivierung des Corrinoid-Eisen/Schwefel-Proteins (CoFeSP). RACo, der ATP-abhängige reduktive Aktivator von CoFeSP, bindet selektiv inaktives Co(II)-CoFeSP und überträgt ein Elektron von seinem reduzierten [2Fe2S]-Cluster auf Co(II) unter ATP-Hydrolyse. In der ersten Förderphase konnten wir zeigen, dass die beiden Proteine abhängig von der Oxidationsstufe des CoFeSP einen festen Komplex bilden in dem der Corrinoid-Cofaktor auf der Oberfläche der ATPase RACo positioniert ist und dabei selektiv Co(II) stabilisiert. Dabei öffnet sich die ATP-Bindestelle von RACo und die ATPase-Aktivität erhöht sich mindestens 35-fach. In der zweiten Förderphase konnten wir zeigen, dass der Elektronentransfer von RACo auf CoFeSP unter optimierten Assay-Bedingungen ca. drei Größenordnungen schneller erfolgt, als zuvor gemessen. Der Elektronentransfer wird zwar durch die Bindung von ATP initiiert, aber erfolgt vor der Hydrolyse des ATPs. Die langsame ATP-Hydrolyse begünstigt die Entstehung eines Elektronentransfer-Gleichgewichts, in dem die Kofaktoren des Elektronen-Donors (RACo) und Elektronen-Akzeptors (CoFeSP) ähnliche Redoxpotentiale haben und ermöglicht einen unidirektionalen Elektronentransfer in dem externe Elektronendonoren oxidiertes RACo erneut reduzieren können. (II.) Untersuchten wir den Mechanismus der Acetyl CoA-Synthase (ACS). ACS kondensiert CO, ein Methyl-Kation und CoA zu Acetyl-CoA an einem nur in der ACS zu findenden [4Fe-4S]-(μ2- SCys)-[Ni((μ2-SCys)2Gly)Ni]-Zentrum. Der Mechanismus der ACS ist in verschiedenen Punkten unklar, wobei der Ort und Art der Substrat-Bindung erste Hinweise geben sollte. Wir haben dazu im ersten Schritt Assays optimiert, um die Bindung von CO und CoA mittels ITC nachzuweisen. Da die ACS in Gegenwart von Spuren von O2 schnell inaktiviert und die Bindung von CO die Gegenwart potenter Reduktionsmittel wie Natrium-Dithionit oder Ti(III)-Citrat verlangt, erforderte dies stringent anoxische Bedingungen. Dabei war insbesondere die Bindung von CO interessant, da wenige andere Methoden existieren die Bindung von Gasen an Ni(I) nachzuweisen. Um die Struktur mit CO zu analysieren, suchten wir neue Kristallisationsbedingungen, in denen ACS einen offenen Gaskanal zeigt. In der bekannten Kristallform der ACS von C. hydrogenoformans war der Kanal geschlossen. Durch Kristallisation in Gegenwart von Ti(III)Citrat konnten wir eine Konformation mit offenem Kanal stabilisieren, in der das für die Substrat-Bindung prädestinierte Ni-Ion tetraedrisch von drei Cystein-Resten und einem Wasser-Liganden koordiniert ist. Nach Inkubation der Kristalle mit Ti(III)-Citrat und CO deutete die Elektronendichte über dem Ni-Ion den Austausch des Wasser-Liganden gegen CO an. Die Bindung von CoA haben wir durch Kokristallisation in Gegenwart von CoA strukturell untersucht. Hierbei kristallisierte ACS in der Konformation mit geschlossenem Gaskanal, in dem größere Substrate über den Solvensbereich an Cluster A binden können. Dabei ist das Ni-Ion quadratisch-planar koordiniert und an der Position, in der zuvor ein Wasser-Ligand war, ist ein Thiol gebunden. Dabei scheint CoA in mehreren Konformationen vorzuliegen, die nicht komplett definiert sind. So konnten wir in diesem Teilbereich die Bindung zweier Substrate an das gleich Ni-Ion von Cluster A nachweisen, was mit einem Ein-Ionen Mechanismus in Einklang wäre.
Publications
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