Transmissionselektronenmikroskop
Final Report Abstract
Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wurde genutzt, um Fragmente eines Klasse IX Myosinmoleküls alleine und an Aktinfilamente gebunden abzubilden. In einem weiteren Projekt wurde das TEM zur Untersuchung der Gehirnentwicklung eingesetzt. Nervenzellen werden aus Vorläuferzellen gebildet, den sogenannten Radialen Gliazellen. Diese bilden ein Epithel, in dem die einzelnen Radialen Gliazellen durch spezielle Adhärenzverbindungen aneinander haften und die Cerebrospinalflüssigkeit vom Hirngewebe abtrennen. Wir konnten mit Hilfe des Transmissionselektronenmikroskops zeigen, dass diese Verbindungen in Mäusen, denen ein bestimmtes Myosinmolekül fehlt, eine veränderte Morphologie und Anordnung im Vergleich mit normalen Mäusen aufweisen. Außerdem wurde das TEM für Studien zur Dynamik der Mitochondrien eingesetzt. Die Mitochondrien sind unentbehrliche Zellorganellen mit vielfältigen Aufgaben. Sie sind von zwei Membranen, einer äußeren und einer inneren begrenzt, wobei die innere Membran starke Faltungen aufweist. Durch die zwei Membranen werden ein Intermembranraum und ein Matrixraum abgetrennt. Wir haben den Einfluss verschiedener Mitochondrienproteine auf die Morphologie der Mitochondrien untersucht. Um die Zellen, welche die zu untersuchenden Mitochondrienproteine exprimierten, identifizieren zu können, verwendeten wir die neu entwickelte APEX-Methode. Sie besteht darin, dass eine gegenüber chemischer Fixierung resistente Peroxidase mit dem Protein von Interesse fusioniert vorliegt. Die Peroxidase ist dann in der Lage, aus einem unsichtbaren Substrat ein im Elektronenmikroskop sichtbares Präzipitat zu erzeugen. Damit kann das Mitochondrienprotein von Interesse einer Membran oder einem Kompartiment des Mitochondriums zugeordnet werden und sein Einfluss auf die Morphologie der Mitochondrien untersucht werden. Des weiteren wurde das Gerät verwendet um damit die Faltung von DNA-Nanostructuren, welche mittels der Origami-Methode hergestellt wurden, zu untersuchen. Bei dieser Methode wird ein langer DNA-Einzelstrang mit Hilfe von kurzen „Heftklammer“-DNA-Oligonucleotiden in einer Hybridisierungsreaktion in eine bestimmte Form gebracht. Dabei bestimmen die Sequenzen der Heftklammer-Stränge die finale Gestalt des Objektes. Solche DNA Origamistrukturen wurden in drei verschiedenen Applikationen eingesetzt: (i) Die Untersuchung der Translations- als auch Rotationsdiffusion von lipophilen DNA-Origamistäbchen auf synthetischen Lipid-Membranen unter Bedingungen von makromolekularem „Crowding“. Hierbei wurde die korrekte Faltung der Origamistrukturen mittels TEM verifiziert. (ii) Die Deformation von Lipidmembranen mittels 2-dimensonaler Gitterstrukturen, welche aus individuellen Origami-Bausteinen selbst-assemblieren. Ziel dieser Arbeiten war es die Funktionsweise von BAR-Domainproteinen künstlich nachzubilden. TEM wurde hier eingesetzt, um die Faltung der individuellen Origamibausteine zu verifizieren als auch um Assemblierung der Bausteine in 2-dimensionale Felder, in denen sie sich wie in einer Ziegelwand zueinander positionieren, zu charakterisieren. (iii) Die Etablierung einer neuen Methode, die es erlaubt Metallpartikel mit einer programmierbaren Form herzustellen. Dabei fungieren DNA-Origamiröhren als Gussform. An einem metallischen Nukleationszentrum im Inneren der Form kann dann weiteres Metall abgeschieden werden, welches dann das Innere der Röhre füllt. Diese Methode wurde für das Wachstum von Goldnanopartikeln entwickelt, welche aufgrund der Form eine stäbchenförmige Gestalt mit quadratischer Grundfläche annahmen. TEM wurde bei allen Schritten der Entwicklung der Methode eingesetzt, d.h. Verifizierung der Origamifaltung, anbringen der Nukleationszentren und testen von vielen verschiedenen Bedingungen für das Partikelwachstum.
Publications
- Shape-controlled synthesis of gold nanostructures using DNA origami molds. Nano Lett. 2014 Nov 12;14(11):6693-8
Helmi S, Ziegler C, Kauert DJ, Seidel R
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Czogalla A, Kauert DJ, Franquelim HG, Uzunova V, Zhang Y, Seidel R, Schwille P
(See online at https://doi.org/10.1002/anie.201501173) - Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by gliaderived neuregulin homolog Vein. Development. 2015 Apr 1;142(7):1336-45
Matzat T, Sieglitz F, Kottmeier R, Babatz F, Engelen D, Klämbt C
(See online at https://doi.org/10.1242/dev.116616) - DNA origami nanoneedles on freestanding lipid membranes as a tool to observe isotropic-nematic transition in two dimensions. Nano Lett. 2015 Jan 14;15(1):649-55
Czogalla A, Kauert DJ, Seidel R, Schwille P, Petrov EP
(See online at https://doi.org/10.1021/nl504158h)
