Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Quantifizierung bei spektral stark überlappenden Fluorophoren: Mit Hilfe der spektralen Detektoren des konfokalen Laser-Scanning (LS) Mikroskops und auf der Grundlage der von uns entwickelten Protokolle für die Aufnahme von Referenzspektren können wir nun Routinemäßig "Multi-Colour" Färbungen bei sich spektral stark überlappenden Fluorophoren durchführen. So konnten an dem konfokalen LS Mikroskop Aufnahmen angefertigt werden, die in einer Vielzahl hochrangiger Publikation unserer und kollaborierender Arbeitsgruppe angefertigt werden. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht dabei immer die möglichst exakte Quantifizierung der angefertigten Aufnahmen. Pixelbasierte quantitative FRET Analysen für die Untersuchung subzellulärer Prozesse: Im Laufe der ersten Jahre wurde eine Reihe von Aufnahmeroutinen entwickelt, um sowohl die Interaktion von Proteinen mit Hilfe von Förster Resonanz-Energietransfer (FRET) zu untersuchen als auch mit Hilfe von FRET basierter Biosensoren Aktivität intrazellulärer Signalmoleküle nachzuweisen. Dafür wurden eine Reite von Kalibrations- und Referenzverfahren etabliert, sodass jetzt Routineuntersuchungen mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden können. In Zusammenarbeit mit Dr. Roland Nitschke (Universität Freiburg) wurden die Funktionalität des Mikroskops wesentlich erweitert. Die etablierten und mittlerweile angewandten Messalgorithmen gehen so weit über sonst übliche Standardaufnahmen hinausgehen. Einfluss der Protein-Protein-Interaktion auf das zelluläre Signalverhalten: Im Rahmen eines Forschungsprojektes wurde die Interaktion der Serotonin-Rezeptoren 5-HT7 und 5-HT1A und dessen Einfluss auf die Regulation der Produktion des Second Messengers cAMP untersucht. Hier wurde Rezeptor-Rezeptor-Interaktion mit Hilfe von der von uns entwickelten Methode lux-FRET quantifiziert und zeitgleich die dynamische Änderung der cAMP-Konzentration mit einem FRET basierten Biosensor nach Stimulation an lebenden Zellen aufgezeichnet. Dies erforderte Trennung und Quantifizierung sich stark spektral überlappender Fluoreszenzsignale, was nur durch die von uns neu entwickelten Verfahren möglich war. Wir konnten so nachweisen, dass die Ausbildung von 5-HT7R-5-HT1AR Heterodimeren die hemmende Wirkung auf die 5-HT1AR-Signalkaskade ausübt. Somit konnte erstmalig ein regulierender Effekt durch Heterodimerisierung von Serotonin-Rezeptoren mit Hilfe kombinierter FRET-Analyse gezeigt werden. Untersuchung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen mittels FRAP: Um die Beweglichkeit der in der Plasmamembran verankerten Rezeptoren und daran anheftender Signalproteine wie Cdc42 zu untersuchen, wurden mit Hilfe des konfokalen LS Mikroskops Experimente durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, welchen Einfluss die Prenylierung und Palmitoylierung der endogen vorkommenden Cdc42-Varianten auf die Ausbildung von dendritischer Filopodien und Dornfortsätzen (Spines) hat. Das "Virtual Research Center" der Medizinischen Hochschule Hannover: Die Arbeitsgruppe Ponimaskin konnte sich mit der vorhandenen Expertise auf dem Gebiet der quantitativen Mikroskopie als wesentlicher Bestandteil des Zentrums „Light Microscopy" innerhalb des "Virtual Research Centers" der MHH etablieren. Das LS Mikroskop wird dabei intensiv für Kooperationsprojekte innerhalb der MHH genutzt. Darüber hinaus liefert die AG Ponimaskin wesentliche Beiträge bei der Erarbeitung und Planung anspruchsvoller mikroskopischer Untersuchungen.
Publications
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(2012) 5-HT7R/G12 signaling regulates neuronal morphology and function in an age-dependent manner. Journal of Neuroscience, 32:2915-2930
Kobe F, Guseva D, Jensen TP, Wirth A, Renner U, Hess D, Müller M, Medrihan L, Zhang W, Zhang M, Braun K, Westerholz S, Herzog A, Radyushkin K, El-Kordi A, Ehrenreich H, Richter DW, Rusakov DA, Ponimaskin E
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(2012) Computational and experimental analysis of the transmembrane domain 4/5 dimerization interface of the serotonin 5-HT(1A) receptor. Molecular Pharmacology, 82:448-63
Gorinski N, Kowalsman N, Renner U, Wirth A, Reinartz MT, Seifert R, Zeug A, Ponimaskin E, Niv MY
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(2012) Heterodimerization of serotonin receptors 5-HT1A and 5-HT7 differentially regulates receptor signalling and trafficking. Journal of Cell Science, 125:2486-2499
Renner U, Zeug A, Woehler A, Niebert M, Dityatev A, Dityateva G, Gorinski N, Guseva D, Abdel-Galil D, Fröhlich M, Döring F, Wischmeyer E, Richter DW, Neher E, Ponimaskin EG
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(2012) Quantitative intensity-based FRET approaches - a comparative snapshot. Biophysical Journal, 103:1821-1827
Zeug A, Woehler A, Neher E, Ponimaskin EG
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(2013) Analysis of receptor-receptor interaction by combined application of FRET and microscopy. Methods in Cell Biology. Elsevier Group. 117:243-265
Prasad S, Zeug A, Ponimaskin E
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(2013) Dual lipidation of the brain-specific Cdc42 isoform regulates its functional properties.. Biochemical Journal. 456:311-322
Wirth A, Chen-Wacker C, Wu YW, Gorinski N, Filippov MA, Pandey G, Ponimaskin E
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(2014) Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. Journal of Clinical Investigation. 124:2136-2146
Bang C, Batkai S, Dangwal S, Gupta SK, Foinquinos A, Holzmann A, Just A, Remke J, Zimmer K, Zeug A, Ponimaskin E, Schmiedl A, Yin X, Mayr M, Halder R, Fischer A, Engelhardt S, Wei Y, Schober A, Fiedler J, Thum T
