Ableitung von Struktur-/Funktionsbeziehungen spezifischer Hemmstoffe der Biosynthese G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
Final Report Abstract
Das Heptacyclodepsipeptid Cotransin wurde ursprünglich als eine Substanz beschrieben, die signalsequenzabhängig die Biosynthese einiger weniger Proteine auf der Ebene des proteinleitenden Sec61-Kanals hemmt (selektive Wirkung). Cotransin könnte damit die Ausgangssubstanz für die Entwicklung von analogen Molekülen sein, die nur noch die Biosynthese von einzelnen Proteinen hemmen (spezifische Wirkung). Mit Hilfe eines Proteomic-Ansatzes konnten wir jedoch zeigen, dass Cotransin weitaus weniger selektiv wirkt, als ursprünglich angenommen. Bei Verwendung einer höheren Konzentration (30 µM) waren fast alle sekretorischen Proteine cotransinsensitiv, die Mehrzahl der integralen Membranproteine dagegen cotransinsresistent. Bei den wenigen cotransinsensitiven Membranproteinen ist es uns in der Folge mit bioinformatischen Methoden und gerichteten Mutagenesen gelungen, in der Signalankersequenz ein Motiv zu definieren, dass die Cotransinsensitivität vermittelt. Ist dieses Motiv in Signalpeptiden vorhanden, vermittelt es auch hier die Cotransinsensitivität. Aufgrund der Ergebnisse der Proteomic-Analyse erscheint es aussichtslos spezifische Cotransinderviate zu entwickeln. Wir haben uns daher auf die Ableitung von Struktur-/Funktionsbeziehungen für das Molekül beschränkt und konnten zeigen, dass sowohl die Integrität des Ringsystems als auch dessen Größe für die Cotransinwirkung entscheidend ist. Ferner scheinen der Leucinrest an Position 6 und der methylierte Alaninrest an Position 7 für die Wirkung entbehrlich zu sein, so dass an diesen Positionen vielleicht Crosslinker eingefügt werden könnten, um die Bindungsstelle des Cotransins näher zu charakterisieren. Im Verlauf der Förderperiode wurde auch ein High-Throughput-Screnning durchgeführt, um kleine Moleküle zu indentifizieren, die in Eukaryonten den SRP-/Translokonpathway inhibieren. Dieser Screen verlief erfolgreich und es wurden insgesamt 27 kleine Moleküle gefunden, die die Biosynthese des Targetproteins (corticocotropin-releasing-factor receptor type 1; CRF1R) auf dieser Ebene hemmen. Darunter konnte bisher eine Substanz identifiert werden, die spezifisch für den CRF1R zu sein scheint und daher möglicherweise dessen Signalpeptid inhibiert. Andere Substanzen inhibierten dagegen die Biosynthese aller Proteine, die den SRP-/Translokonpathway nutzen. Es könnte sich hierbei um Inhibitoren des SRP, des SRP-Rezeptors oder von Sec61 selbst handeln. Die Identifizierung der Targetproteine dieser Substanzen wird derzeit von uns durchgeführt.
Publications
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