Konfokales Laserscanning Mikroskopie-System
Final Report Abstract
Das konfokale Laser-Scanning Mikroskopie-System (CLSM) wurde als Mikroskop für die diversen Projekte der Abteilung Mikrobiologie mit Anforderungen an hochauflösende Bildgebung konzipiert und eingesetzt. Zudem wurde das System mit einer Lebendzellperipherie (Kontrolle von Temperatur, CO2, Luftfeuchtigkeit) und vollständiger Motorisierung ausgestattet. Diese Einrichtungen erlauben sowohl eine hohe Fokus-Stabilität bei längeren Beobachtungszeiten, wie auch eine automatisierte Steuerung von Aufnahmesequenzen für mehrere Positionen in Inkubationsgefäßen. Das Stativ war auch für den Betrieb einer Mikroinjektionseinrichtung ausgestattet. Das System wird in einem S2 Laborbereich betrieben und erlaubt die Beobachtung von Infektionsvorgängen mit Erregern wie Salmonellen im lebenden System. Die Projekte der AG Hensel im Bereich der Zellulären Mikrobiologie verwenden Zellkultur- und Gewebe-Modelle zur Untersuchung der Interaktion von Infektionserregern und eukaryontischen Zellen. Eine zentrale Arbeitstechnik ist dabei die Visualisierung der Veränderungen in Wirtszellen aufgrund der bakteriellen Aktivitäten. Hierfür werden umfangreich Methoden der Lebenszellmikroskopie eingesetzt, die schnelle Veränderungen der Wirtszelle darstellen können, z.B. den Umbau des Zytoskeletts oder Effekte auf den Vesikeltransport. Dazu ist die hohe räumliche Auflösung bedeutend, um die Zusammensetzung von Erregerhaltigen Kompartimenten, und Oberflächenstrukturen der Bakterien hinreichend detailliert darstellen zu können. Mit Hilfe des Systems erfolgte die Untersuchung der Rolle einzelner Domänen des großen nichtfimbrillären Adhäsins SiiE bei der Interaktion von Salmonellen mit polarisierten Epithelzellen. Projekte zur Analyse der F-Aktin-Zytoskelett-Veränderungen bei der Infektion von Salmonellen verfolgen die Auslöschung des Bürstensaums polarisierter Zellen. Die Größe von Mikrovilli ist an der Grenze lichtmikroskopischer Auflösung, konnte aber mit dem Gerät erfolgreich durchgeführt werden. Dabei gelang es, die Rolle von SPI1-T3SS Effektorproteinen bei der Modulation des apikalen Zytoskeletts zu beschreiben. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten ist das Verständnis der Manipulation des endosomalen Systems in Wirtszellen durch intrazelluläre Salmonellen. Zur Beobachtung dieser Effekte wurden regelmäßig Langzeit- Beobachtungen von bis zu 16 h durchgeführt, und während dieses Zeitraums wurden Fusionsereignisse von endosomalen Vesikeln mit der ‚Salmonella-containing vacuole‘ (SCV) verfolgt. Zur experimentellen Manipulation der Erreger-Wirt-Interaktion erfolgten bei diesen Beobachtungen auch Mikroinjektionen von Antikörpern oder Inhibitoren in infizierte Wirtszellen. Mittels pulse/chase-Experimenten mit fluoreszierenden Markern der flüssigen Phase konnte die Entstehung besonders tubulärer Membrankompartimente in Salmonellen-infizierten Zellen charakterisiert werden. Unter Einsatz des Systems gelang es auch, Salmonella-infizierte Zellen für korrelative Licht und Elektronen-Mikroskopie aufzuarbeiten. Hierzu wurden Salmonella-infizierte Zellen mittels Lebendzellmikroskopie verfolgt, bis das Auftreten relevanter Phänotypen beobachtet werden konnte. Anschließend wurden Zellen auf der dem Mikroskop-Tisch fixiert und dann für Ultrastrukturanalysen aufgearbeitet. Durch Einsatz von Zellkulturgefäßen mit Koordinatensystem für die Lebendzellmikroskopie gelang die Korrelation der Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie mit der Ultrastruktur gleicher Regionen einer infizierten Zelle. Weiterführende Arbeiten untersuchen zurzeit die Rolle von Wirtszellproteinen für die intrazelluläre Lebensweise von Salmonellen. Basierend auf einer Proteom-Analyse von Salmonella-modifizierten Endomembranen in Wirtszellen wurde zahlreiche Wirtsfaktoren identifiziert, die mit möglicherweise gezielt von Salmonella rekrutiert werden. Die genaue Lokalisation dieser Proteine und die Dynamik ihres Transports zur SCV werden mit Lebenszell-Mikroskopie untersucht. Hierzu werden Wirtszellen zur Expression von Fusionsproteinen mit GFP oder Derivaten transfiziert, dann mit Salmonellen infiziert und lebend beobachtet.
Publications
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