Identification, cloning and functional characterization of genes related to fire blight resistance in Malus X robusta
Final Report Abstract
Feuerbrand, eine bakterielle Pflanzenkrankheit verursacht durch E. amylovora, stellt eine der bedeutendsten Bedrohungen im Bereich der Apfelproduktion dar und steht somit im Fokus vieler Züchtungsprogramme. Die Züchtung ist jedoch auf Grund der langen juvenilen Phase des Apfels sehr zeitaufwendig und erfordert viele Rückkreuzungsschritte, da Resistenzen vor allem in Wildarten des Apfels vorkommen. Eine Alternative stellt die Herstellung einer cisgenen feuerbrandresistenten Apfelpflanze dar. Hierbei wird ein Feuerbrand-Resistenzgen aus dem primären Genpool des Apfels mittels DNA-Rekombinationstechnologie in anfällige, bereits am Markt etablierte Sorten eingebracht. Innerhalb des Projektes ging es dabei zunächst um die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung des Resistenzgens aus Malus ×robusta 5 (Mr5). Dafür wurde eine phänotypische Evaluierung der Kreuzungspopulation 04208 Idared x Mr5 durchgeführt. An Hand der erhaltenen Daten konnte ein QTL auf Chromosom 3 von Mr5 bestätigt werden, welcher durch den Projektpartner in der Schweiz feinkartiert wurde. So konnte ein BAC-Klon identifiziert werden, auf dem ein Feuerbrand-Resistenzgenkandidat gefunden wurde. Das Gen wurde unter dem nativen Promotor in einen Transformationsvektor ligiert (390p95NMr5Fb1) und Transformationen am JKI und in der Schweiz mit den anfälligen Sorten Pinova, Royal Gala und Gala durchgeführt. Die Funktionalität des Kandidatengens konnte dann durch Inokulation von Veredelungen transgener Gala-Linien mit E. amylovora bewiesen werden. Zusätzlich wurde innerhalb des Projektes der Resistenzmechanismus im Wirt-Pathogen System Mr5 und E. amylovora und die Rolle des Effektors avrRpt2EA untersucht. Es konnten zwei Allele des Effektors nachgewiesen werden. Stämme mit dem C-allel des Effektors waren avirulent gegenüber Mr5, während alle Stämme mit dem S-Allel sowie die avrRpt2EA Deletionsmutante ZYRKD3-1 virulent waren. Zur Bestätigung der Rolle des Effektors im Wirt-Pathogen System wurde die Deletionsmutante ZYRKD3-1 mit beiden Allelen komplementiert. Die Inokulationsversuche an Mr5 mit den komplementierten Stämmen zeigten eine inkompatible Interaktion mit dem C-Allel und eine kompatible Interaktion mit dem S-Allel. Damit konnte für das C-Allel des AvrRpt2EA Effektors eine Gen-für-Gen Beziehung im System Mr5 und E. amylovora bestätigt werden. Im Rahmen der Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus konnten außerdem mittels einer Transkriptomanalyse 211 signifikant unterschiedlich exprimierte Gene nach Inokulation von Mr5 mit dem E. amylovora Wildtyp Ea1189, inkompatible Interaktion, und der avrRpt2EA Deletionsmutante, kompatible Interaktion, identifiziert werden. Die Expression von 90 Genen, von denen 83 in der inkompatiblen Interaktion hochreguliert waren, wurde mittels BioMark™ HD System zu sechs Zeitpunkten nach Inokulation bestimmt. Ergänzend sollten beteiligte Proteine mit Hilfe der 2D-Gelelektrophorese identifiziert werden. Die Methode konnte etabliert und bezüglich der optimalen Proteinmenge, der Auftrennung in der ersten Dimension und der Laufbedingungen optimiert werden. Somit konnte innerhalb des Projektes das erste Feuerbrand-Resistenzgen isoliert, charakterisiert und dessen Funktionalität bewiesen werden. Ebenfalls konnte erstmals eine Gen-für-Gen Beziehung im System E. amylovora und Mr5 mit dem Effektor AvrRpt2EA nachgewiesen werden.
Publications
- Rolle des avrRpt2AE Gens in der Wirt-Pathogenbeziehung Malus × robusta 5 - Erwinia amylovora. Nachwuchswissenschaftlerforum JKI, 29.11.-01.12.2011, Quedlinburg
Vogt I, Wöhner T, Flachowsky H, Hanke M-V, Richter K, Geider K, Peil A
- (2012). QTL mapping for resistance to fire blight using several Erwinia amylovora strains resulting in different host-pathogen-interactions. Acta Horticulturae 976, 509-512
Wöhner T, Vogt I, Richter K, Garcia-Libreros T, Fahrentrapp J, Peil A, Gessler C, Broggini GAL, Hanke M-V, Flachowsky H
- Die Rolle des avrRpt2EA Gens in der Wirt-Pathogenbeziehung Malus × robusta 5 - Erwinia amylovora. 58. Deutsche Pflanzenschutztagung, 11.-14.09.2012, Braunschweig
Vogt I, Wöhner T, Flachowsky H, Hanke M-V, Richter K, Geider K, Peil A
- (2013) Gene-for-gene relationship in the host–pathogen system Malus ×robusta 5 – Erwinia amylovora. New Phytologist: 1262-1275
Vogt I, Wöhner T, Richter K, Flachowsky H, Sundin GW, Wensing A, Savory EA, Geider K, Day B, Hanke M-V, Peil A
(See online at https://doi.org/10.1111/nph.12094)
