Das Permeom der mitochondrialen Außenmembran: Elektrophysiologische und molekulare Identifizierung neuer Kanalproteine
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die zentrale Rolle von Mitochondrien im Stoffwechsel eukaryoter Zellen bedingt einen regen Stoffaustausch über beide Membranen des Organells. Für die Innenmembran wurden diese Transportprozesse bereits sehr detailliert untersucht. Hingegen wurde für die Außenmembran bislang ein eher unregulierter Transport der meisten Stoffe vorwiegend über VDAC angenommen. Durch elektrophysiologische Messungen an nativen, isolierten Außenmembranen des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae fanden wir, dass die Außenmembran weitgehend impermeabel scheint. Dies führte zu unserer Hypothese, dass die mitochondriale Außenmembran, neben den bislang bekannten drei Kanälen Tom40, Por1 und Sam50 weitaus mehr Kanäle enthält als bislang angenommen. Durch einen integrativen Ansatz mit systematischer Fraktionierung von hochgereinigten Außenmembranvesikeln durch blaue Nativgele, gefolgt von elektrophysiologischer Charakterisierung, sowie massenspektrometrischen und bioinformatischen Analysen, konnten wir fünf neue Kanäle elektrophysiologisch charakterisieren und drei davon molekular identifizieren. Für eines dieser Proteine, Mimi, konnten wir zeigen, dass es die Kernkomponente einer neuen Proteinimportmaschinerie für mono- und polytope alpha-helikale Außenmembranproteine darstellt. Darüber hinaus entdeckten wir in Außenmembranen von Trypanosoma brucei Mitochondrien ein bislang unbekanntes Protein, welches wir nach elektrophysiologischen und biochemischen Untersuchungen als den lange gesuchte Präprotein-Translokationskanal identifizieren konnten, das den „missing-link" zwischen eukaryotischem Tom40 und seinen bakteriellen Vorläufern darstellt. Ein überraschender Befund im Rahmen dieses Projektes war der Nachweis einer Reihe von Phosphorylierungsstellen an mitochondrialen Außenmembranprotelnen. Mehrere dieser Phosphorylierungsstellen wurden an den hier beschriebenen Kanalproteinen gefunden. Wir konnten zwei cytosolische Proteinkinasen (CK2 und PKA) identifizieren, welche Mim1 und Tom40 phosphorylieren und die funktionelle Bedeutung dieser Signalmechanismen für Biogenese und Funktion dieser Kanalproteine aufklären.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010). Protein conducting nanopores. J. Phys.: Condens. Matter 22, 454102
Harsman, A., Krüger, V., Bartsch, P., Honigmann, A., Schmidt, O., Rao, S., Meisinger, C . and Wagner, R.
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(2011). Mitochondrial Preprotein Translocase of Trypanosomatids Has a Bacterial Origin. Curr. Biol. 21, 1738-1743
Pusnik, M., Schmidt, O., Perry, A.J., Oeljeklaus, S., Niemann, M., Warscheid, B., Lithgow, T., Melsinger, C. and Schneider, A.
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(2011). Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases. Cell 144, 227-239
Schmidt, O., Harbauer, A.B., Rao, S., Eyrich, B., Zahedi, R.P., Stojanovski, D, Schönfisch, B., Guiard, B., Sickmann, A., Pfanner, N., and Meisinger, C.
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(2011). The mitochondrial Import protein Mim1 promotes biogenesis of multispanning outer membrane proteins. J. Cell Biol. 194, 387-395
Becker, T., Wenz, L.S., Krüger, V., Lehmann, W., Müller, J.M., Goroncy, L., Zufall, N., Lithgow, T., Guiard, B., Chacinska, A., Wagner, R., Meisinger, C. and Pfanner, N.
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(2012). Bacterial origin of a mitochondrial outer membrane protein translocase: New perspectives from comparative single channel electrophysiology. J. Biol. Chem. 287, 31437-31445
Harsman, A., Niemann, M., Pusnik, M., Schmidt, O., Burmann, B.M., Hiller, S., Meisinger, C. Schneider, A., and Wagner, R.
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(2012). Biogenesis of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: protein kinase A phosphorylates the precursor of Tom40 and impairs its import. Mol. Biol. Cell. 23,1618-1627
Rao, S., Schmidt, O., Harbauer, A.B., Schönfisch, B., Guiard, B., Pfanner, N., and Meisinger, C.
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(2012). Horizontal Bilayer for Electrical and Optical Recordings. Materials 5, 2705-2730
Bartsch, P., Walter, C., Selenschik, P., Honigmann, A., and Wagner, R.
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(2013). Differential regulation of the central mitochondrial import receptor by cytosolic and organelle-bound kinases. Cell Metab. 18, 578-587
Gerbeth, C., Schmidt, O., Rao, S., Harbauer, A.B., Mikropoulou, D., Opalinska, M., Guiard, B., Pfanner, N., and Meisinger, C.
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(2013). Single Channel Analysis of Membrane Proteins in Artificial Bilayer Membranes. Methods Mol. Biol. 1033, 345-361
Bartsch, P., Harsman, A., and Wagner, R.
